梁美丹 肖劍 勞嘉倩 林秀敏 陳楷 蔣佳希

摘 要：隨著植物蛋白飲料市場(chǎng)的高速發(fā)展及飲料原料價(jià)格的上漲，在生產(chǎn)加工中摻入廉價(jià)的植物蛋白粉或非產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的植物原料，損害了消費(fèi)者的合法權(quán)益，同時(shí)給食品安全帶來(lái)一定風(fēng)險(xiǎn)。因此，有必要對(duì)植物蛋白飲料摻假鑒別技術(shù)進(jìn)行分析，探討植物蛋白飲料源性成分的新型高通量或絕對(duì)定量分析技術(shù)的研究和應(yīng)用現(xiàn)狀，促進(jìn)新型數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)和微流控技術(shù)開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)植物蛋白飲料摻雜使假行為精準(zhǔn)高效鑒別。

關(guān)鍵詞：植物蛋白飲料;摻假鑒別技術(shù);數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù);微流控技術(shù)

Research Progress on Adulteration Identification Technology of Vegetable Protein Beverages

LIANG Meidan， XIAO Jian*， LAO Jiaqian， LIN Xiumin， CHEN Kai， JIANG Jiaxi

（Guangzhou Institute of Food Inspection， Guangzhou 511400， China）

Abstract： With the rapid development of the vegetable protein beverage market and the rising price of beverage raw materials， the cheap vegetable protein powder or plant raw materials other than product labels were adulterated in production and processing. The legitimate rights and interests of consumers were damaged， and the new food safety issues were introduced. Therefore， it is necessary to analyze the plant protein beverages adulteration identification technology， and explore the application of high throughput identification technology or absolute quantitative analysis technology. As the new digital polymerase chain reaction technology and microfluidic technology will be rapidly developed and applied， and achieved accurate and efficient identification of adulteration for vegetable protein beverages.

Keywords： vegetable protein beverages; adulteration identification technology; digital polymerase chain reaction technology; microfluidic technology

植物蛋白飲料是以植物果仁、果肉及大豆為原料（如花生、杏仁、核桃仁和椰子等），經(jīng)加工、調(diào)配后，再經(jīng)高壓殺菌和無(wú)菌包裝制得的乳狀飲料，其不含或含較少的膽固醇，富含蛋白質(zhì)、氨基酸及適量的不飽和脂肪酸，營(yíng)養(yǎng)成分較全面，深受消費(fèi)者歡迎，已成為飲料市場(chǎng)上不可或缺的產(chǎn)品[1]。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2007年以來(lái)各飲料子行業(yè)增速最快的是植物蛋白飲料，2016年植物蛋白飲料行業(yè)收入為

1 217.2億元，2020年植物蛋白飲料市場(chǎng)高速發(fā)展，增速高達(dá)800%，購(gòu)買人數(shù)上升900%，銷量增速遠(yuǎn)超其他飲料品類，在飲料市場(chǎng)中成長(zhǎng)貢獻(xiàn)15.5%，排名第3。隨著植物蛋白質(zhì)飲料原料價(jià)格的上漲，部分生產(chǎn)企業(yè)為降低生產(chǎn)成本，在飲料中摻入廉價(jià)的植物蛋白粉，或摻入成本低廉的非產(chǎn)品標(biāo)識(shí)的植物原料，如央視在2018年“3·15”晚會(huì)中，曝光了多家企業(yè)在生產(chǎn)核桃露時(shí)未使用核桃漿，而使用成本遠(yuǎn)低于核桃漿的花生醬或核桃香精代替，上述行為嚴(yán)重?cái)_亂社會(huì)市場(chǎng)秩序，損害消費(fèi)者的合法權(quán)益。目前，植物蛋白飲料市場(chǎng)摻雜使假情況比較嚴(yán)重，群眾關(guān)注度高，有研究表明市場(chǎng)上35%蛋白質(zhì)飲料標(biāo)識(shí)的植物源性成分未檢出，存在與產(chǎn)品標(biāo)識(shí)成分及含量嚴(yán)重不符的情況[2]。因此，對(duì)于植物蛋白飲料摻假鑒別技術(shù)研究有重要的實(shí)際意義。

1 檢測(cè)技術(shù)

目前，植物蛋白飲料檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)落后及不全面，采用定性檢測(cè)的方法無(wú)法對(duì)植物蛋白飲料的成分進(jìn)行高通量快速鑒定及品質(zhì)的準(zhǔn)確定量，監(jiān)管部門(mén)不能準(zhǔn)確、快速認(rèn)定產(chǎn)品是否具有摻假行為，給人們的生活質(zhì)量和安全帶來(lái)不穩(wěn)定的因素。目前，針對(duì)植物蛋白飲料中源性成分鑒偽的研究相對(duì)較少，主要集中于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、色譜和質(zhì)譜技術(shù)、電泳技術(shù)以及分子生物學(xué)技術(shù)。

1.1 ELISA檢測(cè)技術(shù)

賴心田等[3]用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)核桃制品中核桃含量的測(cè)定。方娟[4]建立了ELISA定量檢測(cè)核桃蛋白的方法并成功組裝了一款檢測(cè)試劑盒?；诳乖贵w免疫原理的ELISA，由于過(guò)敏原蛋白之間存在一定程度的同源性而極易出現(xiàn)交叉反應(yīng)，加熱等加工工序會(huì)對(duì)植物蛋白飲料蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成很大的影響，從而導(dǎo)致無(wú)法被抗體正確識(shí)別而出現(xiàn)假陰性，檢測(cè)結(jié)果易受植物蛋白飲料工業(yè)化加工流程的影響，同時(shí)存在操作較為煩瑣、檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，不適合應(yīng)用于大批量樣品的檢測(cè)。

1.2 色譜和質(zhì)譜技術(shù)

張敬敬[5]用氣相色譜法建立了核桃乳脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，對(duì)核桃乳質(zhì)量進(jìn)行控制，并對(duì)核桃乳進(jìn)行相似度分析，建立核桃乳摻假模型，定性鑒別核桃乳摻假。張淑霞等[6]采用高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜檢測(cè)核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生源性成分，并初步建立了平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Parallel Reaction Monitoring，PRM）檢測(cè)核桃露中核桃、杏仁、大豆和花生特征肽段的方法。以蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象的色譜和質(zhì)譜技術(shù)雖然可在一定程度上檢測(cè)目標(biāo)源性成分，但其檢測(cè)結(jié)果易受植物蛋白飲料工業(yè)化加工流程的影響，同時(shí)存在操作較為煩瑣、儀器設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)。

1.3 電泳技術(shù)

王斌等[7]利用高效毛細(xì)管電泳技術(shù)獲得杏仁和巴旦木特征遷移峰，以特征峰相對(duì)遷移時(shí)間結(jié)合特征峰相對(duì)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)了杏仁露中巴旦木摻假的半定量分析，半定量限為10%。孫克江等[8]建立十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法鑒定核桃、杏仁、花生和大豆中的蛋白成分，通過(guò)分析不同物種的蛋白質(zhì)，確定核桃、花生、黃豆和杏仁的特征條帶，從而達(dá)到對(duì)食品中植物源性成分的鑒定。由于上述方法是以蛋白質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象，檢測(cè)結(jié)果易受到蛋白飲料深度加工的影響。

1.4 分子生物學(xué)技術(shù)

植物蛋白飲料實(shí)際生產(chǎn)中經(jīng)常要進(jìn)行一系列的高溫處理，會(huì)破壞蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間高溫高壓的處理后，植物DNA仍能保持完整。因此，在植物蛋白飲料源性成分檢測(cè)中，基因水平檢測(cè)方法較蛋白及脂質(zhì)檢測(cè)方法更具優(yōu)勢(shì)。目前，應(yīng)用較為廣泛的分子生物學(xué)技術(shù)主要包括常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)等。常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，DNA條形碼技術(shù)成本低、快速可靠，均被廣泛應(yīng)用于食品中的定性檢測(cè)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度低、檢測(cè)成本低及所需的儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于致病菌、動(dòng)植物源性成分等領(lǐng)域的定性分析。實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)不僅可用于定性檢測(cè)，還可測(cè)定循環(huán)閾值和初始DNA模板濃度進(jìn)行相對(duì)定量。這些技術(shù)各有其優(yōu)點(diǎn)，但卻無(wú)法滿足精準(zhǔn)定量分析的需求，尤其是對(duì)于經(jīng)深加工、目標(biāo)檢測(cè)物質(zhì)豐度較低的植物蛋白飲料類終端類產(chǎn)品。數(shù)字PCR技術(shù)和微流控芯片技術(shù)是近年來(lái)應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的新技術(shù)，可以彌補(bǔ)或解決以上技術(shù)問(wèn)題。

1.4.1 微滴數(shù)字PCR

近年來(lái)，微滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（Dropletdigital Polymerase Chain Reaction，ddPCR）是繼常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR之后的第3代PCR技術(shù)，是基于單分子目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的絕對(duì)定量技術(shù)，可以直接計(jì)數(shù)樣品中靶分子和參考DNA分子的絕對(duì)數(shù)量，不依賴于檢測(cè)效率或外部校準(zhǔn)設(shè)備。該技術(shù)具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高、無(wú)需任何校準(zhǔn)物質(zhì)以及可對(duì)樣品核酸進(jìn)行絕對(duì)定量等優(yōu)勢(shì)，目前已在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、微生物豐度檢測(cè)、病毒載量的絕對(duì)定量和食品中內(nèi)源性成分鑒定等方面得到較廣泛的研究與應(yīng)用[9-12]。ddPCR技術(shù)在植物源性食品真?zhèn)舞b別領(lǐng)域研究相對(duì)較少，郭楠楠等[13]建立了杏仁露中杏仁、花生源性成分ddPCR定量檢測(cè)體系，并對(duì)12個(gè)市售的杏仁露進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在著不同程度的摻假現(xiàn)象。目前，ddPCR技術(shù)在市場(chǎng)上并未形成完善的檢測(cè)體系，在動(dòng)植物源性成分鑒定方面的應(yīng)用相對(duì)較少。

1.4.2 微流控芯片

微流控芯片技術(shù)源于20世紀(jì)90年代MANZ等[14]提出的微型全分析系統(tǒng)的概念，主要是指采用微機(jī)電系統(tǒng)技術(shù)在方寸大小的芯片上加工微米至納米尺度的微通道網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)微尺度下流體的精確操控，在芯片上實(shí)現(xiàn)樣品引入、前處理、混合、化學(xué)反應(yīng)、分離和檢測(cè)等功能，其系統(tǒng)具有微量、高效、成本低、微型化、集成化、高通量和自動(dòng)化等特點(diǎn)。隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的檢測(cè)手段能夠與微流控芯片技術(shù)相結(jié)合，尤其是在生命科學(xué)領(lǐng)域，微流控芯片技術(shù)在核酸檢測(cè)方面得到了廣泛應(yīng)用。以微流控環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）技術(shù)及微流控液滴技術(shù)為代表的微流控PCR技術(shù)在微生物分離篩查、致病菌檢測(cè)、病毒檢測(cè)等方面的研究是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)之一，但在動(dòng)植物成分鑒定、蛋白質(zhì)飲料源性成分鑒定方面的研究較少[15-16]。微流控技術(shù)用于源性成分檢測(cè)將有助于實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品檢測(cè)過(guò)程中的高通量操作，進(jìn)一步提高與分子生物學(xué)交叉的多學(xué)科研究成果用于食品檢測(cè)中的應(yīng)用水平。

2 結(jié)語(yǔ)

鑒于目前植物蛋白飲料摻雜使假檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀，急需建立植物蛋白飲料高通量定性檢測(cè)特征性植物源性成分及絕對(duì)定量一體化的檢測(cè)體系，實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)飲料目標(biāo)成分高通量的快速檢測(cè)，對(duì)產(chǎn)品標(biāo)明的成分含量實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量的檢測(cè)。依據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)特點(diǎn)和檢測(cè)需求，可重點(diǎn)考慮微滴數(shù)字PCR（ddPCR）技術(shù)、微流控芯片技術(shù)的研究應(yīng)用，通過(guò)這兩種技術(shù)手段構(gòu)建一套成熟的特異性強(qiáng)、靈敏度高、絕對(duì)定量的蛋白飲料中植物源性成分高通量檢測(cè)體系，為植物蛋白飲料行業(yè)中摻雜使假等問(wèn)題提供有效的鑒別手段，為國(guó)家食品安全監(jiān)管監(jiān)測(cè)及突發(fā)事件應(yīng)急提供精準(zhǔn)的檢測(cè)技術(shù)支撐。

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