付燕秋，呂志敏，王 智，于 佳

（青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，青島市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究所，山東青島 266000）

啤酒被認(rèn)為是一種微生物安全性較高的飲料，因其含有許多內(nèi)在的抗菌因素，包括酒精（2.5%vol～ 5.0%vol）、啤酒花苦味酸（約為17～55 IBU）、低pH（3.9～4.4）、高濃度二氧化碳（約為0.5%）、低溶氧量（＜0.1 mg/L）和缺乏營養(yǎng)物質(zhì)[1]。此外，啤酒生產(chǎn)加工過程，如糖化、麥芽汁煮沸、巴氏殺菌、無菌過濾和冷藏等對維持微生物穩(wěn)定性起到保護(hù)作用[1]。2012年，中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵酒及其配制酒》（GB 2758—2012），取消了啤酒菌落總數(shù)和大腸菌群的檢測，僅需檢測金黃色葡萄球菌和沙門氏菌。筆者從2019年負(fù)責(zé)成品啤酒微生物檢測以來，共檢測1 000余批次樣品，均未檢出兩種致病菌。這與一些研究結(jié)果一致，在啤酒中食品致病菌的存活率通常很低[2-5]。但HOMPESCH[6]的研究表明，沙門氏菌可在啤酒中存活長達(dá)63 d。L'ANTHO?N等[7]報(bào)告部分食品致病菌可在無酒精啤酒中生長。高松[8]的衛(wèi)生監(jiān)督監(jiān)測報(bào)告結(jié)果顯示，162批次市售啤酒，共檢出致病菌3株，檢出率為1.85%。本文通過在啤酒中接種等量的金黃色葡萄球菌和沙門氏菌，在不同的抑菌條件下，靜態(tài)培養(yǎng)，研究其生長情況，以期為今后啤酒的微生物檢測工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） ATCC6538；鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC14028。培養(yǎng)基：7.5%NaCl肉湯、緩沖蛋白胨水（Buffered Peptone Water，BPW）、Baird-Parker瓊脂、XLD瓊脂和營養(yǎng)瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSC-1304ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHH-150L生化培養(yǎng)箱，重慶四達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；2RH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SPX-250BSH-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；FE20梅特勒酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DensiCHEK plus比濁儀，BioMerieux。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 微生物接種物制備

金黃色葡萄球菌和沙門氏菌菌株分別接種到營養(yǎng)瓊脂平板上活化培養(yǎng)。24 h后，挑取單一菌落用無菌生理鹽水通過比濁儀，配制比濁度為0.5的菌懸液，再用無菌生理鹽水稀釋目標(biāo)接種物約為 105CFU/mL，備用。金黃色葡萄球菌目標(biāo)接種物標(biāo)記為J菌液；沙門氏菌目標(biāo)接種物標(biāo)記為S菌液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)用啤酒準(zhǔn)備

啤酒根據(jù)酒精含量分為無酒精（＜0.5%vol）、中酒精度（2.5%vol～3.6%vol）和高酒精度（≥4.0%vol） 啤酒。實(shí)驗(yàn)用啤酒均為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)剩余樣品，具體見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用啤酒

1.3.3 金黃色葡萄球菌在啤酒中的存活

將表1中的B1、B2、B3、B4和B5用無菌量筒各取250 mL置于無菌均質(zhì)袋中，一式兩份。一份取 0.5 mL J菌液加入各均質(zhì)袋，標(biāo)記為Pn；另一份，不加菌液，作為陰性對照，標(biāo)記為CK-。同時(shí)，再取 0.5 mL J菌液加入250 mL 7.5% NaCl肉湯中，作為陽性對照，標(biāo)記為CK+。從Pn、CK-和CK+各均質(zhì)袋中吸取1 mL，選擇適宜的稀釋度，涂布BP平板，36 ℃培養(yǎng)48 h后，計(jì)數(shù)。將Pn、CK-和CK+各均質(zhì)袋，置于25 ℃，靜態(tài)培養(yǎng)，每天同一時(shí)間 計(jì)數(shù)。

1.3.4 沙門氏菌在啤酒中的存活

實(shí)驗(yàn)操作同1.3.3。其中，J菌液換為S菌液；陽性對照培養(yǎng)基為250 mL緩沖蛋白胨水（BPW）；計(jì)數(shù)方法為20 mL冷卻至46 ℃的XLD瓊脂培養(yǎng)基傾注平板，36 ℃培養(yǎng)24 h后，計(jì)數(shù)。

1.3.5 在無酒精啤酒中儲存溫度和pH值對沙門氏菌存活的影響

啤酒標(biāo)簽上標(biāo)識貯存條件為5～25 ℃[9]。將接種S菌液的無酒精啤酒在5 ℃、15 ℃和25 ℃下，靜態(tài)培養(yǎng)，評估儲存溫度對沙門氏菌存活的影響。本文測得實(shí)驗(yàn)用無酒精啤酒pH值為4.19，在啤酒的典型pH值范圍內(nèi)[10]。沙門氏菌最適生長pH值為6.8～7.8[11]。用無菌過濾的HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值，15 ℃靜態(tài)培養(yǎng)，評估pH值為4.0、4.2、4.5和7.0時(shí)對沙門氏菌存活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌和沙門氏菌在啤酒中的存活情況

金黃色葡萄球菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情況如圖1所示。25℃時(shí)，在P1、P2、P3、P4和P5中只存活了3～5 d，即使在無酒精啤酒P1中也不能存活，說明其在不同酒精度啤酒中均無法啟動(dòng)生長。MENZ等[2]報(bào)道，麥芽汁中低水平的啤酒花苦味酸可以抑制革蘭氏陽性菌生長。圖1進(jìn)一步佐證了這種保護(hù)作用，即使低水平的啤酒花苦味酸也會抑制金黃色葡萄球菌的生長并限制其存活。

圖1 酒精度對金黃色葡萄球菌在啤酒中存活的影響

沙門氏菌在P1、P2、P3、P4和P5中的生存情況如圖2所示。25 ℃時(shí)，在P2、P3、P4和P5中6～9 d 失去活性，而在無酒精啤酒P1中1 d后迅速生長。說明沙門氏菌在中、高酒精度啤酒中無法啟動(dòng)生長，但能在無酒精啤酒中劇烈生長，這與L’ANTHO?N等[7]的研究一致。

圖2 酒精度對沙門氏菌在啤酒中存活的影響

2.2 在無酒精啤酒中儲存溫度和pH值對沙門氏菌存活的影響

儲存溫度對無酒精啤酒中沙門氏菌存活的影響如圖3所示。沙門氏菌在25 ℃時(shí)的生長速度明顯快于15 ℃ 時(shí)，而在5 ℃時(shí)則無明顯增殖現(xiàn)象。25 ℃時(shí)，沙門氏菌在5 d內(nèi)從1.1×105CFU/mL到8.8×107CFU/mL， 達(dá)到最大菌群數(shù)。15 ℃時(shí)，有一個(gè)較長的滯后階段，14 d開始生長，且整個(gè)生長趨勢緩慢。5 ℃時(shí)，沙門氏菌未生長，也未在35 d后完全失活。

圖3 儲存溫度對沙門氏菌在無酒精啤酒中存活的影響

無酒精啤酒的pH值對沙門氏菌存活的影響如圖4所示。當(dāng)無酒精啤酒pH值增加時(shí)，沙門氏菌生長得到增強(qiáng)，生長滯后階段變短。pH為4.2時(shí)，沙門氏菌14 d開始生長；pH為4.5時(shí)，13 d開始生長；pH為7.0時(shí)，僅1 d就開始劇烈生長。而pH為4.0時(shí)，其從10 d開始活性顯著下降，25 d后被滅活。由此可知，pH值是啤酒對沙門氏菌產(chǎn)生抑制作用的一個(gè)重要因素，將無酒精啤酒的pH值從初始的4.2增加至4.5和7.0導(dǎo)致繁殖速度加快和滯后階段減短，而pH值降低至4.0會使其失活。通常啤酒的pH值為3.9～4.4[7]。綜上所述，沙門氏菌在啤酒中難以生存。

圖4 pH值對沙門氏菌在無酒精啤酒中存活的影響

3 結(jié)論

本文研究了啤酒中兩種致病菌的生長和存活情況。在中、高酒精度啤酒中，兩種致病菌均無法生長存活。在無酒精啤酒中，金黃色葡萄球菌失活，這是由于啤酒花苦味酸的存在；沙門氏菌能迅速生長，但降低啤酒pH值生長被抑制。由此可見，國家標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)制要求檢驗(yàn)的兩種致病菌在啤酒中存在的可能性較低，尤其在中、高酒精度啤酒中幾乎沒有致病菌傳播的風(fēng)險(xiǎn)。但由于沙門氏菌在低溫下滅活速度減慢，在低溫保存的鮮啤酒中存在被檢出的風(fēng)險(xiǎn)。此外，由于無酒精（＜0.5%vol）條件可以支持沙門氏菌的生長（特別是在pH值略高的情況下），因此對未經(jīng)巴氏殺菌的無酒精啤酒產(chǎn)品，檢驗(yàn)人員應(yīng)在工作中加強(qiáng)對其的重視。