謝思豪，勾紅潮，卞志標(biāo)，李 斌，蔡汝健，臧瑩安，李春玲

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640；3.廣州市從化區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣州 510900)

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是一種簡單、可靠的基因組編輯工具[1-2]，只需針對目的基因序列設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，通過sgRNA對目的基因核苷酸序列進(jìn)行識別定位，引導(dǎo)Cas9蛋白特應(yīng)性結(jié)合并發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，造成特定位點(diǎn)上DNA雙鏈損傷，其在修復(fù)的過程中可實(shí)現(xiàn)基因組特定位點(diǎn)的DNA缺失、插入或堿基突變[3]。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已廣泛用于各種細(xì)胞的基因編輯和修飾，為疫苗生產(chǎn)過程中提高病毒產(chǎn)量提供了一種可行性策略。張爽等[4]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)基因敲除PK-15細(xì)胞系，與對照細(xì)胞相比，敲除IRF3基因顯著增加了豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)拷貝數(shù)。張?jiān)叫愕萚5]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建了敲除2’,5’寡腺苷酸合成酶2(OAS2)基因的豬腎上皮細(xì)胞(porcine kidney epithelial cells,PK-15)，將豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)感染PK-OAS2-KO細(xì)胞系，結(jié)果顯示敲除OAS2基因能夠顯著促進(jìn)CSFV復(fù)制。

PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，具有143 kb的雙鏈線性DNA，編碼70多種蛋白質(zhì)[6]。PRV的自然宿主是豬，但它可以感染大多數(shù)哺乳動物，包括豬、牛、馬、嚙齒動物和犬，對養(yǎng)殖業(yè)危害巨大[7-8]。 近年來人感染PRV的情況多有發(fā)生[9]。 PRV在豬外周神經(jīng)系統(tǒng)的三叉神經(jīng)節(jié)中可建立終身潛伏感染[10]。在某些情況下，PRV可重新激活，繼而導(dǎo)致PRV在豬場的反復(fù)流行，難以控制和根除。目前，豬偽狂犬病的防控以疫苗接種為重要手段，其中以PRV Bartha-K61為代表[11]。因此，提高PRV Bartha-K61病毒產(chǎn)量對疫苗生產(chǎn)具有重要意義。

程序性細(xì)胞死亡是哺乳動物宿主防御病原感染的重要途徑，壞死作為程序性細(xì)胞死亡的一種炎癥形式，在對抗病毒感染中起著重要作用[12]。壞死的激活依賴于受體相互作用蛋白激酶3(receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3)和混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣(mixed lineage kinase domain-like，MLKL)的信號級聯(lián)反應(yīng)[13-14]。MLKL是RIPK3的功能底物，即在細(xì)胞壞死中被RIPK3激活的下游蛋白[15]。在MLKL磷酸化被激活后形成寡聚體，這些寡聚體被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)膜上，導(dǎo)致細(xì)胞壞死[16-17]。前期研究表明，穩(wěn)定敲低RIPK3或MLKL基因表達(dá)可以減少PRV GD-WH野毒變異株誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死，并可以提高PRV GD-WH野毒變異株病毒滴度[18]。為了構(gòu)建可促進(jìn)PRV Bartha-K61增殖的細(xì)胞株，在前期研究基礎(chǔ)上，本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對PK-15細(xì)胞MLKL基因?qū)?yīng)的染色體序列進(jìn)行雙sgRNA剪切，通過單克隆純化獲得MLKL基因缺失的PK-15細(xì)胞株(PK-15 MLKL-KO)，以期為提高PRV Bartha-K61等疫苗株的培養(yǎng)滴度提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒與質(zhì)粒

PK-15細(xì)胞、PRV GD-WH株(PRV GD-WH)、PRV Bartha-K61疫苗株(PRV Bartha-K61)均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所豬病研究室保存；大腸桿菌Trans10感受態(tài)細(xì)胞購自全式金生物技術(shù)有限公司；CRISPR/Cas9載體質(zhì)粒pX459 pSpCas9-2Apuro-MCS和輔助載體質(zhì)粒EZ-GuideXH均購自Addgene公司。

1.2 主要試劑

限制性核酸內(nèi)切酶BbsⅠ、Hind Ⅲ、XhoⅠ均購自New England Biolabs公司；T4 DNA Ligase、T4 DNA Ligase Buffer均購自TaKaRa公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher Scientific公司；碘化丙啶(PI)溶液購自Beyotime Biotechnology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG多克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG多克隆抗體、兔抗MLKL多克隆抗體、小鼠抗GAPH單克隆抗體均購自Beyotime Biotechnology公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的豬MLKL基因序列(Gene ID:100736836)，通過在線CRISPR設(shè)計(jì)工具(http:∥crispr.mit.edu/)設(shè)計(jì)2對特異性sgRNA序列(表1)。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 MLKL基因sgRNA序列

1.4 MLKL-sgRNA載體構(gòu)建

將合成后的單鏈sgRNA退火形成雙鏈，分別與經(jīng)BbsⅠ酶切的CRISPR/Cas9載體pX459 pSpCas9-2A-puro-MCS和輔助載體EZ-GuideXH通過T4 DNA Ligase 16 ℃連接過夜，獲得pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重組質(zhì)粒并測序鑒定。以Hind Ⅲ和XhoⅠ對獲得的2個(gè)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收后將線性化酶切產(chǎn)物16 ℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans10感受態(tài)細(xì)胞，通過氨芐抗性平板篩選挑取單克隆，進(jìn)行菌落PCR篩選，將篩選到的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)一步測序驗(yàn)證。

1.5 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將PK-15細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前將生長狀態(tài)良好的PK-15細(xì)胞接種至6孔板中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)，按照Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑說明書將5 μg MLKL-sgRNA載體轉(zhuǎn)染至PK-15細(xì)胞中。

1.6 敲除MLKL基因的單克隆細(xì)胞株篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，更換含有0.70 μg/mL嘌呤霉素的10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行藥物篩選，連續(xù)篩選5 d，觀察到陰性對照組細(xì)胞全部死亡后，將得到的陽性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)1周后消化成單個(gè)細(xì)胞，使用有限稀釋法將藥物篩選得到的陽性細(xì)胞稀釋至96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，約2周后挑選生長狀態(tài)良好的單克隆細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.7 MLKL基因敲除PK-15細(xì)胞株的鑒定

從96孔板中挑選生長狀態(tài)良好的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，連續(xù)傳代到P10代后通過PCR、測序和Western blotting對MLKL基因的穩(wěn)定敲除效果進(jìn)行鑒定。取部分細(xì)胞提取DNA，使用針對敲除靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列為：F：5′-GCCATCTCTTACCTCCCCTGA-3′；R：5′-AAACTAAGGCTGGAAGGGAGCA-3′，退火溫度58 ℃，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長度為1 149 bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，檢測堿基插入或者缺失情況。通過Western blotting檢測MLKL蛋白的表達(dá)，篩選MLKL基因敲除的PK-15 MLKL-KO細(xì)胞株。

1.8 病毒滴度測定

將PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞匯合度至70%～80%時(shí)，以MOI=10的PRV GD-WH和PRV Bartha-K61分別感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞，并置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附1 h。吸附結(jié)束后棄去接種物，用PBS清洗細(xì)胞3次，更換為維持培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。按照12、24及36 h不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞上清病毒液，將病毒液反復(fù)凍融3次，離心取上清液，將上清液分別10倍遞減梯度稀釋，感染96孔板中的PK-15細(xì)胞，病毒感染后共觀察4 d，記錄各孔的病變情況，按照Reed-Muench法測定各上清液的病毒滴度。

1.9 細(xì)胞壞死測定

將PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞接種在96孔板中，待細(xì)胞匯合度至70%～80%時(shí)，以MOI=10的PRV GD-WH和PRV Bartha-K61分別感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞，36 h后棄細(xì)胞培養(yǎng)基，用PI溶液在4 ℃下染色10 min，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的PI染色情況。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次，使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒MLKL-sgRNA構(gòu)建

pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重組質(zhì)粒經(jīng)Hind Ⅲ和XhoⅠ雙酶切(圖1A)，酶切產(chǎn)物連接、轉(zhuǎn)化，將篩選到的陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)一步測序驗(yàn)證，測序結(jié)果表明MLKL-sgRNA載體構(gòu)建成功(圖1B)。

2.2 MLKL基因敲除PK-15單克隆細(xì)胞系構(gòu)建

瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，出現(xiàn)1 149和502 bp 2條條帶(圖2A)；對2條條帶進(jìn)行回收、純化和測序，序列比對分析結(jié)果顯示，PK-15 MLKL-KO細(xì)胞在sgRNA靶點(diǎn)處缺失647 bp(圖2B)。通過Western blotting對PK-15 MLKL-KO細(xì)胞中MLKL基因敲除效果進(jìn)一步鑒定，結(jié)果顯示，PK-15 MLKL-KO細(xì)胞未檢測到MLKL蛋白的表達(dá)(圖2C)。表明本試驗(yàn)成功構(gòu)建了MLKL基因敲除的PK-15 MLKL-KO細(xì)胞株。

2.3 MLKL基因敲除對PRV GD-WH和PRV Bartha-K61病毒滴度的影響

由圖3A可知，感染后12～24 h，PRV GD-WH在PK-15 MLKL-KO細(xì)胞中的病毒滴度極顯著或顯著高于PK-15細(xì)胞(P<0.01；P<0.05)；感染后36 h，PRV GD-WH在PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞中的病毒滴度無顯著差異(P>0.05)。由圖3B可知，感染后12～36 h，PRV Bartha-K61在PK-15 MLKL-KO細(xì)胞中的病毒滴度極顯著高于PK-15細(xì)胞(P<0.01)，其中，PRV Bartha-K61感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞24 h后，病毒滴度分別為105.1和106.3TCID50/mL，提高了約15.8倍；在感染36 h后，病毒滴度分別為105.9和106.9TCID50/mL，提高了10倍。

2.4 MLKL基因敲除對PRV GD-WH和PRV Bartha-K61誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的影響

PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15和PK-15 MLKL-KO細(xì)胞后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的PI染色(紅色熒光)的情況，結(jié)果顯示，PK-15 MLKL-KO細(xì)胞感染組PI陽性細(xì)胞明顯少于PK-15細(xì)胞感染組(圖4)。

①A，pX459-sgRNA1和EZ-sgRNA2重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物；B，MLKL-sgRNA測序結(jié)果。②M，DL5000 DNA Marker；1，EZ-sgRNA2；2，pX459-sgRNA1①A，Double digestion products of pX459-sgRNA1 and EZ-sgRNA2 recombinant plasmids；B,Sequencing results of MLKL-sgRNA.②M，DL5000 DNA Marker;1，EZ-sgRNA2;2，pX459-sgRNA1圖1 MLKL基因敲除重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of MLKL gene knockout recombinant plasmid

①A，MLKL基因敲除PK-15細(xì)胞PCR鑒定；B，敲除MLKL基因的PK-15細(xì)胞測序結(jié)果；C,PK-15細(xì)胞中MLKL蛋白的表達(dá)。②M，DL2000 DNA Marker；1，PK-15細(xì)胞；2，PK-15 MLKL-KO細(xì)胞①A,PCR identification of MLKL gene knockout PK-15 cell;B,Sequencing results of MLKL gene knockout PK-15 cell;C,Expression of MLKL protein in PK-15 cell.②M,DL2000 DNA Marker;1,PK-15 cell;2,PK-15 MLKL-KO cell圖2 敲除MLKL基因的PK-15 細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.2 Identification results of PK-15 cells with MLKL gene knockout

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)*,Significant difference (P<0.05);**,Extremely significant difference (P<0.01);ns,No significant difference (P>0.05)圖3 不同感染時(shí)間PRV GD-WH(A)和PRV Bartha-K61(B)病毒滴度Fig.3 Virus titer of PRV GD-WH (A) and PRV Bartha-K61 (B) at different infection time

圖4 MLKL基因敲除對PRV GD-WH和PRV Bartha-K61誘導(dǎo)細(xì)胞壞死的影響(200×)Fig.4 Effects of MLKL gene knockout on PRV GD-WH and PRV Bartha-K61 induced cell necrosis (200×)

3 討 論

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的新型基因編輯技術(shù)，相較于與之前的ZFNs和TALENs基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)僅需要設(shè)計(jì)特異性sgRNA便可以對特定基因位點(diǎn)進(jìn)行修飾，極大地降低應(yīng)用成本、縮短時(shí)間[19]。同時(shí)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具有特異性高、脫靶率低且可以同時(shí)對多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行編輯的優(yōu)勢。為了提高編輯的成功率，本研究使用了雙sgRNA編輯系統(tǒng)，經(jīng)鑒定建立的PK-15 MLKL-KO細(xì)胞株成功敲除了MLKL基因647 bp，Western blotting也未檢測到MLKL蛋白表達(dá)。

在減毒活疫苗的生產(chǎn)過程中，提高病毒滴度是關(guān)鍵。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的RNaseL敲除促進(jìn)了PRV Bartha-K61疫苗株的復(fù)制[20]。為了提高Vero細(xì)胞中輪狀病毒疫苗的低產(chǎn)量，研究者采用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯了Vero細(xì)胞的NUE2、NAT9、COQ9、EMX2等基因，使輪狀病毒疫苗的產(chǎn)量顯著增加[21-23]。程序性細(xì)胞壞死是一種重要的宿主防御機(jī)制，通過誘導(dǎo)細(xì)胞死亡限制病毒增殖，在對抗病毒感染中起著重要作用。MLKL是程序性細(xì)胞壞死的關(guān)鍵執(zhí)行者，脂多糖(LPS)、病毒核酸和干擾素等均可誘導(dǎo)MLKL所介導(dǎo)的細(xì)胞壞死[24-26]。本研究擬構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定敲除MLKL基因的PK-15細(xì)胞株，用于PRV Bartha-K61疫苗生產(chǎn)過程中提高病毒滴度，結(jié)果表明，敲除MLKL基因顯著提高了PRV Bartha-K61的復(fù)制能力。與PK-15細(xì)胞相比，PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO細(xì)胞24 h后，病毒滴度提高了約15.8倍；在感染36 h后，病毒滴度提高了10倍。此外，穩(wěn)定敲除PK-15細(xì)胞MLKL基因可以提高PRV GD-WH病毒滴度，這與Gou等[18]研究結(jié)果一致。

程序性細(xì)胞壞死是重要的抗病毒宿主的防御，其通過防止受感染細(xì)胞成為病毒工廠來限制病毒的傳播。 研究表明，Ⅰ型單純皰疹病毒(HSV-1)[27]、牛痘病毒(VV)[28]、寨卡病毒(ZIKV)[29]、甲型流感病毒(IAV)[30]均能誘導(dǎo)程序性細(xì)胞壞死的發(fā)生。多種病毒感染模式的例子強(qiáng)調(diào)了程序性細(xì)胞壞死對宿主免疫的重要性。MLKL基因缺失促進(jìn)了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61在PK-15細(xì)胞中的復(fù)制，與PK-15細(xì)胞相比，PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO細(xì)胞后，壞死細(xì)胞明顯減少。PK-15 MLKL-KO細(xì)胞對PRV Bartha-K61增殖的促進(jìn)作用可能與程序性壞死通路的抑制和細(xì)胞活性的增加有關(guān)，而MLKL缺失細(xì)胞株可能有潛力用于生產(chǎn)其他病毒的減毒疫苗，但敲除MLKL基因影響PRV Bartha-K61增殖的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了MLKL基因敲除的PK-15細(xì)胞株，與PK-15細(xì)胞相比，PK-15 MLKL-KO細(xì)胞顯著提高了PRV GD-WH和PRV Bartha-K61的復(fù)制和存活能力，PRV GD-WH和PRV Bartha-K61感染PK-15 MLKL-KO細(xì)胞后，壞死細(xì)胞明顯減少。