姜曉明，湯 承，岳 華

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041)

A群牛輪狀病毒(Bovine rotavirus A，BRVA)是導(dǎo)致新生犢牛腹瀉的重要病原[1-2]。病牛主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退及水樣腹瀉等癥狀，新生犢牛感染BRVA后發(fā)病率為60%～80%，死亡率高達(dá)30%[3]。BRVA呈世界范圍內(nèi)流行，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。目前尚未研制出治療BRVA感染的特效藥物，疫苗是防控傳染病最經(jīng)濟(jì)有效的手段，目前僅有美國研制的G6型單價(jià)BRVA減毒活苗用于臨床[5]，也有牛輪狀病毒(BRV) DNA疫苗、病毒樣顆粒疫苗、植物可食用疫苗[6-8]的研究報(bào)告，中國尚無商用BRVA疫苗。

VP4蛋白是BRVA的外衣殼刺突蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是BRVA的重要保護(hù)性抗原之一[9]，但VP4蛋白較大，完整表達(dá)存在困難且溶解性差[10]。 VP4蛋白在胰蛋白酶的作用下裂解為VP8和VP5亞基[11]，VP8亞基上有4個(gè)中和表位[12-13]和5個(gè)線性B細(xì)胞表位，攜帶VP4的主要抗原表位，與VP4蛋白一樣能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體且免疫應(yīng)答強(qiáng)度相當(dāng)[14-16]，可見VP8亞基是制備BRVA亞單位疫苗的潛在靶點(diǎn)。本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P[1]型BRVA VP8蛋白，并免疫兔評價(jià)其免疫原性，以期為研發(fā)BRVA亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、血清及試驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌TOP10和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、pET-30a(+)載體均購自天根生化科技(北京)有限公司；兔抗G6P[1]型BRVA血清、G6P[1]型BRVA病毒液(TCID50：105.76)、G8P[1]型BRVA病毒液(TCID50∶105.39)均由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備保存。1.8～2.2 kg成年雄性新西蘭大白兔購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG購自Abbkine公司；TMB、Ultra- Signal超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物均購自四正柏(北京)生物科技有限公司；HisCap 6FF鎳離子純化柱購自常州天地人和生物科技有限公司；Imidazole購自BioFroxx公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Boster(武漢)公司；DL5000 DNA Marker和PageRuler預(yù)染蛋白Marker均購自Thermo Fisher Scientific公司；IPTG購自Sigma公司。

電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)均購自天能(上海)科技有限公司；MONTANIDE ISA 201 VG 購自賽比科(上海)特殊化學(xué)品有限公司；凝膠半干轉(zhuǎn)印裝置Trars-Blot SD和多功能免染蛋白印跡系統(tǒng)均購自Bio-Rad公司。

1.3 P[1]型BRVA VP8基因表達(dá)載體構(gòu)建

參照國內(nèi)流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1](GenBank登錄號：MN937517)VP8基因序列進(jìn)行優(yōu)化，在不改變?nèi)魏伟被崆闆r下，使其密碼子偏好性接近大腸桿菌。在其5′-端增加酶切位點(diǎn)NdeⅠ，3′-端增加酶切位點(diǎn)XhoⅠ，N-端添加His標(biāo)簽，將序列送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，將合成的序列與經(jīng)過NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切的pET-30a(+)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，經(jīng)PCR鑒定正確的陽性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 P[1]型BRVA VP8重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

參考王珍賢等[17]方法將重組質(zhì)粒pET30a-VP8轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有30 μg/mL卡那霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落，震蕩培養(yǎng)10 h后，挑取轉(zhuǎn)化后單菌落于含30 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)，當(dāng)D450 nm值達(dá)到0.6時(shí)，將菌液分2組，分別添加0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，一組20 ℃誘導(dǎo)過夜，另一組37 ℃誘導(dǎo)6 h。誘導(dǎo)后離心收集菌體，以PBS 1∶100(W/V)重懸，超聲破碎15 min后離心收集上清與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE，使用多功能免染蛋白印跡系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件分析灰度值。

1.5 P[1]型BRVA VP8重組蛋白的純化

誘導(dǎo)后菌體使用溶解液(50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl、0.2 mmol/L PMSF)溶解，超聲破碎15 min后離心收集上清，按照鎳瓊脂糖親和層析蛋白純化方法以5 mL HisCap 6FF鎳離子純化柱進(jìn)行純化，收集到的組份經(jīng)SDA-PAGE檢測。將純度高的重組蛋白組份使用透析液(50 mmol/L Tris、300 mmol/L NaCl)透析，每隔6 h換一次透析液，共透析4次。透析后的蛋白使用PEG20000包埋濃縮至原蛋白體積的1/2，0.45 μm濾膜過濾，分裝至1.5 mL管中，每管1 mL，于-80 ℃凍存。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定P[1]型BRVA VP8重組蛋白濃度。

1.6 P[1]型BRVA VP8重組蛋白Western blotting鑒定

參考王珍賢等[17]方法對P[1]型BRVA VP8重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后將P[1]型BRVA VP8重組蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入1∶ 1 000 稀釋的兔抗G6P[1]型BRVA陽性血清，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，加入1∶ 5 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，加ECL顯色，多功能免染蛋白印跡系統(tǒng)拍照。 鑒定P[1]型BRVA VP8重組蛋白反應(yīng)原性。

1.7 動(dòng)物分組與免疫

4只成年健康兔分為2組，每組2只。將P[1]型BRVA VP8重組蛋白稀釋為1 mg/mL，與201佐劑按1∶1(V/V)比例混合，試驗(yàn)組每只兔頸背部皮下注射0.5 mg重組蛋白，首免第2周加強(qiáng)免疫1次，共免疫2次；對照組注射等體積的PBS。首免前0周和第1次免疫免后第1～5周對試驗(yàn)兔耳緣靜脈采血并分離血清，用于抗體測定。

1.8 間接ELISA方法檢測兔血清抗體的消長

使用1 μg/mL P[1]型BRVA VP8重組蛋白包被96孔酶標(biāo)板100 μL/孔，4 ℃包被過夜，用4% PEG6000于37 ℃封閉1 h，加入1∶64 000稀釋的待檢血清，同時(shí)設(shè)立陰性孔(未免疫兔血清)與空白對照孔(1% BSA)，37 ℃孵育1 h。加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶20 000稀釋)，37 ℃孵育1 h。TMB 37 ℃顯色15 min，2 mol/L濃硫酸終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定D450 nm值。以≥Cut Off值(陰性孔D450 nm值×2.1)為陽性，反之為陰性。計(jì)算免疫前后各階段每組兔血清抗體D450 nm平均值。

1.9 兔血清中和效價(jià)的測定

利用ELISA方法檢測抗體水平最高的兔血清，56 ℃水浴30 min后進(jìn)行病毒血清中和試驗(yàn)，分別測定兔血清對G6P[1]與G8P[1]毒株的中和效價(jià)。用DMEM營養(yǎng)液將待檢血清分別稀釋100和10倍，再用DMEM營養(yǎng)液在96孔板中倍比稀釋(21、22、23、……、210)，每個(gè)稀釋度設(shè)立4個(gè)對照孔，同時(shí)設(shè)立陽性對照孔(100 μL病毒液加100 μL維持液)與陰性對照孔(200 μL維持液)。其余試驗(yàn)步驟按照病毒中和試驗(yàn)固定病毒稀釋血清法進(jìn)行，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)孔數(shù)至第4天，計(jì)算兔血清中和效價(jià)。 Reed-Muench氏血清中和效價(jià)計(jì)算公式如下：

距離比例=(50%-低于50%的病變率)/(高于50%的病變率-低于50%的病變率)

中和效價(jià)的反對數(shù)=低于50%的病變率的血清稀釋度的對數(shù)+距離比例×稀釋系數(shù)的對數(shù)

2 結(jié) 果

2.1 P[1]型BRVA VP8基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果顯示，在約500與5 000 bp 出現(xiàn)2個(gè)條帶(圖1)，大小與預(yù)期一致，測序結(jié)果顯示目的基因序列正確插入pET-30a(+)。

2.2 P[1]型BRVA VP8重組蛋白表達(dá)情況

重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測，在約20 ku處有特異性條帶，重組蛋白為可溶性表達(dá)，且重組菌在37 ℃誘導(dǎo)6 h比20 ℃誘導(dǎo)過夜表達(dá)量更高(圖2)，經(jīng)Image J軟件分析37 ℃誘導(dǎo)6 h條件下目的蛋白占總蛋白的62.08%(表1)。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET30a-VP8雙酶切電泳圖Fig.1 Double enzyme digestion electrophoresis of recombinant expression plasmid

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，IPTG誘導(dǎo)前總蛋白；2，20 ℃上清；3，20 ℃沉淀；4，37 ℃上清；5，37 ℃沉淀M，Protein Marker；1，Total protein before IPTG induction；2，Supernatant at 20 ℃;3，Precipitation at 20 ℃；4,Supernatant at 37 ℃；5，Precipitation at 37 ℃圖2 重組蛋白表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of recombinant protein

表1 不同溫度蛋白表達(dá)情況

2.3 P[1]型BRVA VP8重組蛋白的純化與濃度

純化的P[1]型BRVA VP8重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE顯示呈單一電泳條帶，大小為20 ku，蛋白純度>99%(圖3)。BCA試劑盒測定蛋白濃度為2.74 mg/mL，每升菌液可得到10.96 mg純化重組蛋白。

圖3 純化的P[1]型BRVA VP8重組蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of purified P[1] BRVA VP8 recombinant protein

2.4 P[1]型BRV VP8重組蛋白反應(yīng)原性檢測

Western blotting 結(jié)果顯示，重組蛋白能與兔抗G6P[1]型BRVA血清抗體結(jié)合，在約20 ku處可見特異反應(yīng)條帶(圖4)，證實(shí)P[1]型BRVA VP8重組蛋白具有反應(yīng)原性。

圖4 P[1]型BRVA VP8重組蛋白 Western blotting 檢測Fig.4 Western blotting detection of P[1] BRVA VP8 recombinant protein

2.5 兔血清抗體的消長情況

免疫后不同時(shí)間試驗(yàn)兔血清抗體水平檢測結(jié)果顯示，首免1周后抗體開始出現(xiàn)并迅速上升，于第3周達(dá)到高峰，至第5周仍維持在較高水平(圖5)。

2.6 P[1]型BRVA VP8重組蛋白誘導(dǎo)兔產(chǎn)生中和抗體

P[1]型BRVA VP8重組蛋白免疫兔血清對同源和異源BRVA的中和試驗(yàn)結(jié)果見表2、3。采用Reed-Muench氏法計(jì)算免疫兔血清對G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效價(jià)分別為1∶17 783和1∶64。說明P[1]型BRVA VP8重組蛋白對同源毒株具有良好的中和活性，對異源毒株具有部分交叉中和活性。

圖5 免疫兔血清抗體消長曲線Fig.5 Fluctuation curve of serum antibody in immunized rabbits

表2 血清對G6P[1]型BRVA毒株中和試驗(yàn)結(jié)果

表3 血清對G8P[1]型BRVA毒株中和試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

BRVA呈世界范圍內(nèi)流行，該病原導(dǎo)致的高發(fā)病率對養(yǎng)牛業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，目前尚無特效藥物可用于治療BRVA引起的疾病，疫苗是預(yù)防和控制BRVA最有效的策略。VP4蛋白為BRVA結(jié)構(gòu)蛋白，決定病毒的P型，且可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生[18]。但BRVAVP4基因較長(全長2 359 bp)，完整表達(dá)存在困難[19]。VP4在胰蛋白酶作用下可裂解成VP8與VP5亞基，Dunn等[15]通過真核表達(dá)輪狀病毒(RV) VP4、VP8、VP5蛋白，并將其作為免疫原分別免疫小鼠產(chǎn)生的抗體中和效價(jià)分別為1∶640至1∶10 240、1∶1 640至1∶10 240、1∶640至1∶2 560，證實(shí)VP8重組蛋白與VP4蛋白一樣能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，且免疫效果相當(dāng)，具有研發(fā)亞單位疫苗的潛力。流行病學(xué)調(diào)查顯示,中國牛群中存在多種基因型BRVA，G6P[1]型是優(yōu)勢流行株[20-21]，因此本研究合成了G6P[1]型BRVA毒株VP8基因序列，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)P[1]型BRVA VP8重組蛋白。

原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡單、時(shí)間短、成本低，且表達(dá)量高，是表達(dá)外源蛋白的首選方案。但原核表達(dá)的蛋白沒有經(jīng)過修飾，不一定具有活性，而BRVA VP4蛋白抗原表位大多為線性，不需要翻譯后修飾[22]，且Nasiri等[23]、Kim等[24]均證實(shí)BRVA VP8原核重組蛋白免疫雞后可產(chǎn)生抗體。本研究結(jié)果顯示，VP8重組蛋白可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平中和抗體，證實(shí)原核表達(dá)不影響B(tài)RVA VP8蛋白的免疫原性。原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白主要以包涵體與可溶性2種形式存在，包涵體表達(dá)需要復(fù)性，復(fù)性過程復(fù)雜，復(fù)性過程中變性劑與去垢劑的使用可能會引起蛋白質(zhì)的改變，在一定程度影響蛋白的免疫原性[25]。本研究采用可溶性表達(dá)策略獲得大量P[1]型 BRVA VP8可溶性蛋白，無需復(fù)性且易于純化，為BRVA VP8重組蛋白的生產(chǎn)策略提供了參考。

目前商品化BRVA疫苗僅有美國USDA批準(zhǔn)的G6型單價(jià)減毒疫苗[26]，也有BRVA滅活疫苗、DNA疫苗、亞單位疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗等的研究報(bào)告，常繼濤等[5]制備的BRVA 基因重配二價(jià)減毒疫苗免疫牛后可產(chǎn)生高水平的中和抗體，中和抗體效價(jià)最高可達(dá)1∶20 480。張儉偉等[27]制備BRV CHLY株滅活疫苗免疫昆明小鼠可檢出高水平IgG抗體，證實(shí)其具有良好的免疫原性。Wei等[28]利用BRVA GSB01株VP7基因原核表達(dá)VP7重組蛋白，制備亞單位疫苗免疫小鼠對初生乳鼠保護(hù)率達(dá)91.7%。BRVA DNA疫苗、植物轉(zhuǎn)基因疫苗等均具有免疫原性[29-31]。亞單位疫苗免疫與其他疫苗相比不僅能誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生高水平抗體，還具有安全性較高、成本低、操作簡單等優(yōu)勢，具有良好的市場潛力，為進(jìn)一步研發(fā)BRVA亞單位疫苗提供參考數(shù)據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究以pET-30a(+)為載體，以大腸桿菌BL21(DE3)為表達(dá)工程菌成功高效表達(dá)了P[1]型BRVA VP8蛋白，該蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，為進(jìn)一步研發(fā)BRVA亞單位疫苗提供參考。