郭鑾英，李家磊，金芹芹，馬 駿，劉 全

(1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所,北京 100081)

丙型肝炎病毒(Hepacivirus)是一類有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)成員。2020年，國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Virus,ICTV)將丙型肝炎病毒分為14個不同病毒種。目前為止，除了田鼠可被丙型肝炎病毒F和J型感染外，其他病毒種均存在宿主特異性。A型丙型肝炎病毒感染馬[1]，B、C型感染猴和人[2]，D型感染猴[3]，E、F、G、H、I和J型感染嚙齒動物[4]，K、L和M型感染蝙蝠[5]，N型感染牛[6]。

長期以來，丙型肝炎病毒屬只有人丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)1個種。HCV在自然情況下，只感染人和黑猩猩，是導致人類慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要病原體之一[7]。全球約有5 800萬人感染慢性HCV，每年約有150萬名新感染者，2019年約有29萬人死于丙型肝炎[8]，目前尚無針對HCV的有效疫苗，由于缺乏合適的動物模型，HCV的致病機理及疫苗的研制受到極大的阻礙，積極治療及控制病毒感染成了主要防控手段。

近年來隨著高通量測序技術的廣泛應用，研究者在不同動物物種中發(fā)現(xiàn)了丙型肝炎病毒，包括馬[9-10]、嚙齒動物[11]、蝙蝠[5]和多種非靈長類動物[2]。目前該病毒屬已增加至14個病毒種(A～N種)，其中最新的病毒種是——N型丙型肝炎病毒(Hepacivirus N，HNV),2015年，德國首次報道在奶牛血清中發(fā)現(xiàn)該病毒，因此也稱牛丙型肝炎病毒(Bovine hepacivirus,BovHepV)，HNV同HCV相似，能造成宿主無明顯臨床癥狀的急性和慢性感染[12]，因此盡管沒有肝損傷跡象，但HNV的感染對畜牧業(yè)的發(fā)展及與病毒密切接觸的農(nóng)民和育種人員健康均構成潛在威脅。目前HNV的研究及報道內容有限，國內更是缺乏對HNV研究進展的系統(tǒng)整理，筆者就HNV的病原學研究、流行情況及檢測方法方面的研究進展進行綜述，以期為HNV的病原學發(fā)展、發(fā)病機制、人畜共患感染潛力的研究提供參考。

1 HNV特征

1.1 HNV的形態(tài)結構

HCV呈球形，直徑50 nm，有囊膜，病毒核心直徑約30 nm[13]，詳細結構尚不明確。而黃病毒科成員的病毒顆粒形態(tài)、基因組結構和復制方式相似[14]，加之丙型肝炎病毒屬病毒在體外細胞中增殖能力有限，目前尚無HNV分離成功的報道，因此可參照HCV的病毒顆粒形態(tài)，尋找HNV的病毒顆粒并觀察記錄。

1.2 HNV的基因組結構及功能

HNV的基因組結構及功能與黃病毒科病毒成員相似。 HNV為單股正鏈RNA病毒，長約8.8 kb。HNV基因組包含非編碼區(qū)5′-UTR、3′-UTR及1個長開放閱讀框(ORF)。ORF編碼1個含2 779個氨基酸的前體多蛋白，前體多蛋白在信號肽酶和蛋白酶共同作用下，被加工成約10個蛋白，其中包括3種結構蛋白：衣殼蛋白C(Core,C)、囊膜蛋白E1(為糖蛋白)、囊膜蛋白E2(含有能誘導產(chǎn)生中和抗體的抗原表位)。此外，還有7種非結構蛋白p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[15]。其中，5′-UTR、NS3及NS5B是HNV的高度保守區(qū)，NS3作為解旋酶和蛋白酶，還具有部分RNA聚合酶復合物的功能，NS3負責多聚蛋白酶的大部分剪切作用，而宿主蛋白酶參與剩余的剪切作用[13]。

圖1 丙型肝炎病毒基因組模式圖[14]Fig.1 Hepacivirus genome model map[14]

1.3 HNV的遺傳多樣性

2019年，Gang等[16]根據(jù)HCV的分類原則，將HNV分為1個基因型和7個亞型(A～G亞型)，2021年，Shao等[17]將HNV分為2個基因型和8個亞型(圖2)，其中HNV的A和F亞型主要存在于德國；加納流行B、C亞型；巴西流行D亞型；中國廣東、江蘇及四川鑒定發(fā)現(xiàn)存在E、G和H亞型[16-19]，表明HNV基因型和亞型的地理分布復雜。

整體上，HNV的基因多樣性遠不如HCV豐富，一方面，可能是因為已有的HNV研究成果是建立在地理隔離較大的牛群上，意味著可能存在更多的HNV有待發(fā)現(xiàn)，這與在歷史上人們發(fā)現(xiàn)不同HCV基因型的過程相似[20]；另一方面，可能是人類圈養(yǎng)動物的行為對病毒多樣性有一定的影響，如影響了HNV毒株跨地域傳播及基因重組。最后，想要更詳細地研究HNV的遺傳多樣性，需要更大的樣本量、縱向研究或動物感染試驗，對不同牛種的HNV流行情況進行調查也有助于了解病原與病原、病原與生態(tài)之間的進化關系。

值得注意的是，近幾年隨著高通量測序技術的發(fā)展，HNV基因亞型的種類不斷增加，分布情況也逐步改變。截至2021年中國至少存在HNV的4種亞型[17]，這可能是由于中國活牛國際貿(mào)易頻繁，促進了HNV的跨界傳播。此外，目前僅在中國廣東、江蘇、云南和四川等有限地區(qū)的牛中檢測到HNV[16,18-19]，擴大HNV流行病學調查范圍，可更好地揭示中國HNV的遺傳多樣性和流行病學特征。

1.4 HNV的致病機理

研究表明，持續(xù)的HCV感染與原發(fā)性肝癌、肝硬化和自身免疫性肝炎有關[21]，但非人類靈長類動物、嚙齒動物、蝙蝠、牛和馬的肝炎病毒的致病機理和特征尚不明確。

有研究發(fā)現(xiàn)，兩頭持續(xù)性感染HNV的牛檢測不到病毒抗體[22]。已知人或動物慢性感染病毒時，在血清中基本能檢測到病毒抗體，但當慢性感染HCV的患者共感染人類免疫缺陷綜合征病毒(HIV)時，其CD4+T細胞衰竭引起的免疫抑制會導致檢測不到HCV抗體[23-24]。據(jù)此推測這2頭?？赡苁谴嬖跈C體免疫抑制，另一種推測是HNV可通過垂直傳播使幼畜產(chǎn)生特異性免疫耐受。

HNV 5′-UTR中存在1個核糖體進入位點(internal ribosome entry site,IRES)，可與宿主因子microRNA-122(miR-122)結合，在不依賴5′-UTR帽子結構的情況下顯著增強病毒翻譯效率[25-26]。牛肝臟組織中存在大量miR-122，在HNV生命周期中起著關鍵作用[27]，未來的研究集中于miR-122是如何影響病毒復制的過程，或可闡明HNV的致病機理。

2 HNV的流行病學研究

2.1 臨床癥狀

人急性感染HCV常因無明顯臨床癥狀而被忽略，感染者不能自行清除病毒則發(fā)展為慢性感染，這是導致肝炎和肝癌的主要原因[28]。有證據(jù)表明，馬感染丙型肝炎病毒時病毒的清除速度比人更快速，因此只會引起較輕微的肝臟炎癥,且馬的品種和年齡也會影響病毒感染結果[29]。

HNV同大多丙型肝炎病毒相似，有強嗜肝性，可造成牛無明顯臨床癥狀的急性和慢性感染[29-31]，HNV慢性感染時間可達9個月甚至更久[22]。但感染HNV的牛肝臟生化指標正常，未見肝損傷或病變[32-33]，表明肝損傷與肝臟內病毒滴度之間沒有相關性。盡管這一發(fā)現(xiàn)出人意料，但對于肝病毒感染來說并不少見，如HCV驅動肝損傷的發(fā)病機制主要是免疫介導的[34]，此外，參考HCV從感染到致病甚至引起肝癌一般需要幾十年的時間，目前沒有HNV感染引起動物產(chǎn)生臨床癥狀的相關報道可能正是因為HNV的慢性感染尚未發(fā)展到臨床期其宿主就被宰殺。

2.2 流行情況

HNV在牛群中呈高度流行趨勢。自2015年Christine等[12]首次通過高通量測序技術在德國奶牛血清中發(fā)現(xiàn)一種新型丙型肝炎病毒HNV后，世界范圍內多個研究陸續(xù)報道了HNV的在牛群中流行率在0.2%～19.9%[6,12,20,22,33-35]。2015年，研究者在非洲牛群中檢測到HNV并對12個養(yǎng)殖場的牛群進行核酸篩查，結果顯示，6個牛場具有陽性病例[6]。2017年，Canal等[32]利用貝葉斯系統(tǒng)分析方法證明HNV可能至少在1996年就在巴西流行，比德國的報道要早20年。2019年，中國商業(yè)化的血清中檢測到HNV核酸[16]。值得一提的是，2021年，有研究者在中國廣東的蜱中發(fā)現(xiàn)HNV新亞型并獲得全基因組[17]，提示蜱可能是HNV潛在的傳播媒介。

2.3 易感宿主

目前認為?？苿游餅镠NV的主要宿主，其中以牛為主，有可能感染共同圈養(yǎng)的羊，病毒感染無性別及年齡差異[36]。2020年，強欣[37]首次在云南的羊體內發(fā)現(xiàn)HNV，羊是?？蒲騺喛频慕y(tǒng)稱，與牛親緣關系較近，所以牛羊一同飼養(yǎng)造成HNV感染羊的可能性非常大?？紤]到其他肝病毒的物種特異性，HNV可能不會感染?？埔酝獾奈锓N，但動物丙型肝炎病毒的 NS3/4A 蛋白酶可切割動物宿主及人的先天免疫接頭——線粒體抗病毒信號蛋白 (mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)來規(guī)避宿主的免疫反應，導致干擾素產(chǎn)生減少并有助于丙型肝炎病毒的持續(xù)感染[38]，在人獸共患病暴露的情況下，人類MAVS可能無法有效抑制這些非人類病毒的復制。

2.4 傳播途徑

丙型肝炎病毒幾乎完全通過血液、血液制品和被血液污染的物體進行傳播。Gather等[39]在一項馬的研究中，揭示了動物丙型肝炎病毒存在垂直傳播的可能。

對于牛而言，受血液污染的注射器是最重要的傳播因素。初步懷疑未更換的針頭、精液為HNV潛在的感染源，具體的傳染源、傳播途徑及傳播機制還需深入研究。德國一項HNV流行病學調查顯示，陽性血清宿主(牛)的鼻咽拭子核酸檢測為陰性[12]，表明該病毒可能不是通過鼻分泌物在動物之間傳播的。中國在商品化的血清中檢測出HNV核酸[16]，揭示HNV可能垂直傳播給胎牛。2021年在中國廣東蜱中發(fā)現(xiàn)HNV新亞型[17]，但蜱蟲可能只是病毒的傳播載體，而不是病毒的自然宿主。

3 HNV的檢測診斷

目前，黃病毒科病毒的檢測方法已得到發(fā)展和推廣，可分為基于抗原、抗體的免疫學檢測方法和基于核酸序列的分子生物學檢測方法兩類[40]。免疫學方法包含酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)、間接免疫熒光試驗(IFA)、中和抗體試驗(VNT)、熒光素酶免疫沉淀反應系統(tǒng)(luciferase immunoprecipitation systems,LIPS)等[25]。分子學方法有直接測序、PCR、特異性探針雜交法等。

HNV的鑒定及檢測采用何種方法主要取決于實驗室的現(xiàn)有條件及目的。成熟的免疫學方法對試驗條件要求不高，對臨床而言，免疫學檢測方法提供了快速、簡便、高效的方法；評估病毒在動物種群中受感染的比率及感染既往史，免疫學(血清學)調查可提供比核酸檢測更真實的結果。對于流行病學研究而言，確定病毒基因型、準確定位到病毒亞型的核酸檢測方法也是必需的。每種方法都有各自的優(yōu)點和不足，所有這些方法都能正確辨別病毒基因組別，但只有核苷酸測序能有效區(qū)分病毒亞型。傳統(tǒng)檢測方法結合多組學聯(lián)合分析可更全面、更系統(tǒng)、更深入地研究新發(fā)病毒的生物學特征及其感染宿主后的發(fā)病機理，能為病毒的異質性特征分析、新型靶向藥物開發(fā)和疫苗研發(fā)提供更為可靠的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

3.1 分子生物學診斷

Elia等[31]利用針對5′-UTR基因區(qū)的實時熒光定量RT-PCR探針法發(fā)現(xiàn)在配對的血清和肝臟樣本中病毒載量之間存在正相關現(xiàn)象[34]，表明病毒血癥水平可能反映了肝臟中的病毒量。

針對新型、未知病毒或變異較活躍的病毒，如丙型肝炎病毒，高通量組學測序技術與傳統(tǒng)分子生物方法相比具有顯著優(yōu)勢，僅需投入少量核酸即可構建文庫得到大量數(shù)據(jù)，是科學研究中強有力的工具，HNV就是基于高通量組學測序技術發(fā)現(xiàn)并進行深入研究的[5,41-42]。隨著高通量組學方法的快速發(fā)展，先前報道的HNV保守引物已不適用于新發(fā)現(xiàn)的HNV基因亞型的檢測，需研究者不斷更新檢測方法。

3.2 免疫學診斷

ELISA是利用表達重組蛋白作為抗原，抗體與酶復合物結合，通過顯色來檢測血清中病毒的抗體水平[43]。ELISA方法操作簡便、特異性強、靈敏度高、時間短、效率高，適用于臨床檢測數(shù)量較多的血清樣品[44]，以及牛羊群HNV的流行病學調查，目前HNV的ELISA檢測研究還完全空白。

有研究者構建HNVNS3基因的LIPS檢測方法[22]，但該方法與馬丙型肝炎病毒存在交叉反應現(xiàn)象，在此之前也有報道馬丙型肝炎病毒NS3融合蛋白與牛血清樣本產(chǎn)生免疫反應[10]，因此免疫學檢測方法也存在不足之處。

4 HNV的預防控制

伴隨養(yǎng)殖模式多樣化、養(yǎng)殖密度高、從業(yè)人員素質參差不齊、對HNV沒有足夠的認識，HNV防控形勢還遠不盡如人意。截至目前，既無有效的治療方法，又無免疫預防制劑用來防控HNV。

控制HNV的主要目標是為了進一步預防畜群出現(xiàn)感染或持續(xù)性感染，但尚無經(jīng)濟可行的控制措施?？刂艸NV首先需通過檢疫篩查和淘汰感染動物，畜群要避免引入感染動物，這個策略成本略高，因其需要對畜群進行血清學調查并盡量把陽性動物隔離，使用核酸探針和RT-PCR可能更敏感，但成本較高。另一種方法是只允許免疫成年動物引入畜群，但目前尚無HNV的預防制劑。

HNV的防控策略很大程度上依賴于嚴格的生物安全。HNV可能通過血液、垂直傳播及節(jié)肢動物叮咬途徑感染牛，養(yǎng)殖場噴灑殺蟲劑滅蚊和清除蚊及蜱等的滋生可有效減少HNV的感染；群體注射疫苗時應加強監(jiān)控，杜絕注射針頭的交叉使用；此外做好環(huán)境消毒，建立經(jīng)濟、快速的檢測方法，及時監(jiān)測、發(fā)現(xiàn)并隔離病牛，加強HNV的流行病學研究是預防和控制HNV傳染的重要措施。

5 小結與展望

在過去的十年中，已在不同動物中發(fā)現(xiàn)了HCV同源病毒，極大促進了對HCV起源和進化的理解，并有利于在同源動物模型中研究HCV感染的發(fā)病機制和免疫應答能力。特別需要指出的是，HCV具有很強的變異能力[45]，可能導致感染率的增加或不可預測的宿主適應性，可能是導致其跨種傳播的重要因素。目前，尚不清楚HNV是否會感染人類，而全世界牛的種群規(guī)模巨大，存在多種直接和間接(即食源性)感染途徑，突出了其作為病毒宿主的作用，可能需對這些新病毒進行監(jiān)測和詳細描述，以排除其對公共衛(wèi)生造成的風險。

與其他病毒相比，HNV的研究進展甚微，除了其為2015年新發(fā)現(xiàn)的病毒以外，主要有以下原因：①HNV感染通常是無癥狀或非致命性的；②丙型肝炎病毒在細胞中的增殖能力有限，HNV的分離培養(yǎng)體系還沒有完善；③HNV動物模型尚未建立起來，這些因素給研究者們在HNV上開展工作帶來了極大的挑戰(zhàn)。因此，建立和優(yōu)化HNV的分離培養(yǎng)體系及動物模型是需要解決的首要問題。除此之外，今后的研究方向可分為以下幾點：①建立完善且高效的診斷方法，如ELISA檢測法；②加強HNV的基因結構與功能的基礎研究；③建立系統(tǒng)的HNV流行病學資料；④加強對病毒溯源、變異及演化機制方面的研究，明確病毒的傳播規(guī)律及病毒變異與致病性之間的關系；⑤加強HNV與牛肝臟疾病的相關性研究，揭示HNV的入侵途徑、致病機制、逃逸機制、免疫機制等；⑥研發(fā)高效的預防和治療藥品，如疫苗等。

隨著科學技術的進步，發(fā)現(xiàn)和鑒定新的病原微生物的能力越來越強。從發(fā)現(xiàn)HCV的存在到鑒定其病毒序列經(jīng)歷了14 年，到2003年科學家們發(fā)現(xiàn)并鑒定嚴重急性呼吸綜合征病毒(SARS-CoV)耗費了幾個月[46]，而如今鑒定SARS-CoV-2只用了不到1個月[47-48]。未來是否還會出現(xiàn)新的致病性病原微生物難以預測，但目前的科學技術讓人們有信心也有能力盡早發(fā)現(xiàn)鑒定病原微生物，通過進一步研究來控制其感染對人類或動物健康帶來的危害。