張 蘭，姚一凡,2,3，陳樹吾,2,3，馬芳芳,2,3，許 瑾，楊 琨,2,3

(1.西北民族大學生命科學與工程學院,蘭州 730030;2.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心,甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心,蘭州 730030;3.西北民族大學生物醫(yī)學研究中心,生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室,蘭州 730030)

氧是動物機體生存的必要物質(zhì)，在低氧條件下細胞將激活諸多適應(yīng)性反應(yīng)，使氧供應(yīng)滿足生物代謝、能量和氧化還原等需求。細胞對周圍氧環(huán)境的變化很敏感，氧濃度改變是一種生理刺激，會觸發(fā)細胞中某些機制，導致細胞凋亡或適應(yīng)低氧環(huán)境存活[1]。低氧誘導因子是低氧環(huán)境的主要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細胞在低氧環(huán)境下的適應(yīng)性，并起主導作用[2]，如調(diào)控降低低氧反應(yīng)中氧化磷酸化，增加糖酵解等來增加三磷酸腺苷(ATP)的產(chǎn)量[3]。通過與低氧適應(yīng)性基因之間的相互作用調(diào)控細胞增殖、凋亡、細胞外基質(zhì)代謝、細胞遷移及炎癥等過程。

1 細胞低氧培養(yǎng)

氧是動物細胞培養(yǎng)過程中的必要條件，細胞通過氧產(chǎn)生的能量進行代謝。大多數(shù)細胞在常氧條件下(21或37 ℃)培養(yǎng)，但有報道指出，活體狀態(tài)下各組織細胞的氧分壓不同，如動物血液中氧體積分數(shù)為10%左右，軟骨細胞為0～7%，腦組織為3%～14%，肺泡血管為14%，骨髓腔為1%～7%等[4]。馬金蘭等[5]研究發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)大鼠腎小球內(nèi)皮細胞可引起細胞增殖，并具有時間依賴性。 Christine等[6]也驗證了這一觀點，通過計算累計數(shù)量來確定細胞在長期培養(yǎng)中的增殖能力；在低氧條件下(3% O2)培養(yǎng)的細胞群落形成單位數(shù)較高，細胞的增殖率顯著增長[7]。故低氧培養(yǎng)細胞有助于細胞增殖活性。

Yu等[4]在犬骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的研究中發(fā)現(xiàn)，低氧促進了BMSCs的增殖、遷移和分化。Wang等[8-9]研究結(jié)果顯示，在低氧條件下培養(yǎng)的BMSCs增加了體內(nèi)/外神經(jīng)元分化潛力，降低了細胞的擴張和衰老，增加分化成骨、脂肪和軟骨的能力；其進一步比較低氧對大鼠脂肪干細胞和骨髓源性干細胞擴增和軟骨分化影響，結(jié)果顯示低氧增加了脂肪干細胞和骨髓源性干細胞軟骨分化潛能，減少了體內(nèi)軟骨損傷。低氧培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞的適應(yīng)性研究結(jié)果顯示，低氧改善了細胞的固有特性，對于開發(fā)干細胞療法至關(guān)重要[10]。張姝婷等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件(2%～9% O2)顯著提高了細胞體外擴增的生長動力學及趨化因子受體的表達，也證實低氧可提高干細胞治療效果。有報道指出低氧有助于體外治療靶點的鑒定，如低氧培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞的細胞外囊泡減輕了慢性哮喘小鼠的過敏性氣道炎癥和氣道重塑，增強了小鼠的抗哮喘作用[12]；低氧預處理后的脂肪干細胞與支架相結(jié)合可使尿道管腔直徑變大，并且保留尿道形態(tài)，通過上調(diào)血管生成和糖酵解作用更好地促進尿道重建[13]。 目前，越來越多的動物細胞種類、低氧培養(yǎng)方法及檢測手段被應(yīng)用到科研、醫(yī)療等領(lǐng)域，低氧細胞培養(yǎng)相關(guān)研究逐漸成為熱點。

2 低氧相關(guān)調(diào)控因子

低氧誘導因子是低氧微環(huán)境適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，包括低氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelia growth factor,VEGF)、低氧促有絲分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF)和促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)等，能應(yīng)答細胞內(nèi)氧濃度的降低，對多種低氧適應(yīng)性基因進行調(diào)控，其通過與胞質(zhì)中的下游靶基因、轉(zhuǎn)錄因子和胞內(nèi)激活因子之間的相互作用調(diào)控細胞增殖、凋亡等過程，使細胞適應(yīng)低氧狀態(tài)得以存活，且可上調(diào)機體糖代謝相關(guān)生理指標，并參與糖代謝有關(guān)基因的調(diào)節(jié)，對低氧條件下細胞的發(fā)生、發(fā)展有重要作用(圖1)。

2.1 HIF

HIF是一種堿性異二聚體蛋白，HIF復合物由O2依賴的α亞單位(HIFα)和β亞單位(HIFβ)組成。其中HIFβ屬于芳香烴類受體蛋白。HIFα有3種獨立亞基，HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，它們結(jié)構(gòu)相似，功能卻不同。HIF-1α是氧敏感亞基，是多條信號通路中介導低氧信號的轉(zhuǎn)導中樞，具有重要作用。當細胞在低氧條件下培養(yǎng)時，胞質(zhì)中的轉(zhuǎn)錄因子被激活進入核內(nèi)，特異性結(jié)合靶DNA序列，從而調(diào)控靶基因的表達。在體外模擬低氧環(huán)境培養(yǎng)心血管細胞，HIF-1α的過表達增加了血管生成基因的表達。HIF-1α還直接調(diào)控Sentrin特異性蛋白酶1(Sentrin-specific protease 1,SENP1)并作用于血管內(nèi)皮細胞內(nèi)，使VEGF表達增加[14]，對心臟起到保護作用。HIF-1α在心臟肥大時過表達，使細胞膜上的Ca2+內(nèi)流增加，激活鈣調(diào)磷酸酶通路，從而發(fā)揮抗凋亡作用[15]。 牛鐵生等[16]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α對中樞神經(jīng)也具有保護作用，在低氧條件下能上調(diào)小鼠腦組織中HIF-1α mRNA表達，在中樞神經(jīng)中是重要的低氧調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子。HIF-2α表達具有特異性，

圖1 低氧相關(guān)調(diào)控因子相互關(guān)系示意圖Fig.1 Correlation diagram of hypoxia-related regulatory factors

對于靶基因調(diào)控與HIF-1α不同，主要介導慢性低氧期的機體反應(yīng)，在不同動物器官中的表達不同，組織胚胎發(fā)育時期表達較高，而在成年表達較低，與HIF-1α功能上既相似，但又相互獨立，二者在不同細胞之間表達差異機制還需進一步探索[17]。HIF-3α與HIF-1α和HIF-2α結(jié)構(gòu)上差異大，功能也有很大不同，在轉(zhuǎn)錄水平上未發(fā)現(xiàn)直接受其調(diào)控的基因。其主要存在于動物心臟、胎盤組織、骨骼肌及肺臟組織中，其他組織少有表達，作為新發(fā)現(xiàn)的低氧誘導因子家族成員，其功能還不明確[18]。

2.2 VEGF

VEGF能促進全身各組織器官中血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和趨化。低氧是VEGF表達中最重要的誘因，VEGF是低氧條件下HIF-1α的靶基因，HIF-1α與VEGF基因的5′-端增強子結(jié)合位點相互作用，從而調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄與表達。Semenza等[19]研究證實了HIF-1α可調(diào)節(jié)VEGF的轉(zhuǎn)錄和翻譯，HIF-1α使VEGF表達上調(diào)且具有相似的時間依賴性。此外，用siRNA技術(shù)抑制HIF-1α，細胞系中VEGF表達量明顯下降，HIF-1α的調(diào)控作用也進一步得到證實[20]。 韓志偉等[21]報道指出，抑制HIF-1α/VEGF可抑制細胞的增殖。

2.3 HIMF

HIMF屬于富含半胱氨酸的抵抗素樣分子家族，主要結(jié)構(gòu)是由111個氨基酸編碼而成的10-半胱氨酸殘基序列，分子質(zhì)量約為9.4 ku，具有多種生物學功能，最早發(fā)現(xiàn)于低氧小鼠肺臟組織分離出的一種分泌蛋白，其在低氧條件下肺動脈高壓形成，具有刺激血管收縮、細胞增殖、血管再生及肺血管重塑等多種作用[22]。

目前，低氧條件下HIMF介導的信號通路有Ca2+通道、PI3K/Akt/mTOR及PI3K/Akt-NFκB等。在低氧下，HIMF參與細胞內(nèi)儲存的Ca2+釋放，在肺動脈平滑肌細胞外Ca2+濃度為零，使細胞內(nèi)Ca2+濃度增加。吉廉治[22]為了證實細胞增殖是否也受Ca2+調(diào)控，加入Ca2+螯合劑，發(fā)現(xiàn)HIMF明顯降低，HIMF可能作為一個配體通過與受體結(jié)合來影響整個細胞內(nèi)Ca2+的釋放，HIMF也可激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,Akt)磷酸化，而磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的抑制劑能抑制HIMF激活Akt磷酸化。低氧條件下HIMF增加細胞內(nèi)第二信使Ca2+濃度后進一步激活PI3K/Akt/mTOR等通路，促進DNA合成，從而促進肺血管收縮反應(yīng)和低氧性肺血管重塑形成[23]。此外，HIMF于氣道上皮細胞研究中發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt通路參與HIMF誘導核因子κB (nuclear factor kappa-B,NF-κB)激活VEGF及血管黏附分子-1(vascular adhesion molecule,VCAM-1)表達，參與細胞有絲分裂、血管生成、炎癥和血管收縮等過程。

HIMF還能與Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)功能性結(jié)合，使得細胞BTK磷酸化，通過激活該通路引起細胞遷移。Burke等[24]研究發(fā)現(xiàn),在低氧條件下HIMF通過細胞因子對炎癥反應(yīng)起調(diào)控作用，介導促炎癥微環(huán)境形成，從而促進循環(huán)細胞的招募、記憶、分化等，形成肺血管重塑。

2.4 EPO

EPO是紅細胞生成調(diào)控過程中一種重要的糖蛋白激素。目前已證實在低氧刺激條件下，EPO在腎臟[25]、肝臟[26]等多個組織中均表達。在低氧刺激下EPO的適應(yīng)性調(diào)控對于紅細胞適應(yīng)能力至關(guān)重要[27]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下HIF-1α通過與EPO基因的啟動子結(jié)合實現(xiàn)EPO的轉(zhuǎn)錄，HIF-1α降解減緩，從而使EPO等下游靶基因表達增強[28]。Lee等[29]在HIF途徑與紅細胞增多癥研究中發(fā)現(xiàn)，EPO的轉(zhuǎn)錄受一種獨特的氧敏感機制的調(diào)控，在這一途徑中，脯氨酸羥化酶域蛋白(PHD)對轉(zhuǎn)錄因子HIF-α的α亞基進行特異性羥基化，從而使HIF-α被腫瘤抑制蛋白(VHL)降解。 在低氧條件下，HIF-α翻譯后修飾被抑制，從而穩(wěn)定HIF-α并促進EPO的轉(zhuǎn)錄激活,進而明確低氧條件下HIF-1α與EPO的相互調(diào)控作用。

2.5 轉(zhuǎn)錄生長因子-β

轉(zhuǎn)錄生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)是具有多種生物學功能的生長因子，主要存在于哺乳動物。在低氧培養(yǎng)大鼠腎小球內(nèi)皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，低氧條件下TGF-β1表達量明顯比常氧下高，并隨低氧時間延長而增加[30]，說明低氧與TGF-β1存在間接聯(lián)系。低氧培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞發(fā)現(xiàn)，HIF-1α高表達后TGF-β的mRNA與蛋白表達水平也顯著增高，而HIF-1α低表達TGF-β的表達也顯著降低，沉默內(nèi)源性HIF-1α后，TGF-β表達沒有變化，從而證實了HIF-1α與TGF-β的調(diào)控關(guān)系[31]。此外，胡媚[32]研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)TGF-β-PI3K/AKT-HIF-1α信號通路可抑制HIF-1α及AKT表達，進而抑制細胞增殖。

2.6 磷酸甘油酸激酶1

磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)是可調(diào)節(jié)糖酵解的蛋白激酶，催化糖酵解途徑中兩個產(chǎn)生ATP的反應(yīng)之一，與能量產(chǎn)生及氧化還原平衡有極大關(guān)系[3]，PGK1也被歸類為兼職蛋白，除在糖酵解和糖異生中的作用，還包括DNA復制和修復、血管生成、纖溶酶原結(jié)合和細胞侵襲等[33]。Xu等[34]研究發(fā)現(xiàn)，低氧使PGK1的表達量增加，并調(diào)節(jié)凋亡基因表達。此外，研究發(fā)現(xiàn)低氧條件下激活HIF-1α并與下游靶基因啟動子區(qū)的乏氧反應(yīng)元件結(jié)合，進而調(diào)控PGK1的轉(zhuǎn)錄，通過穩(wěn)定上調(diào)PGK1的表達促使葡萄糖吸收、糖酵解和線粒體代謝等過程[35]，為細胞代謝提供ATP，從而提高低氧誘導細胞糖酵解能力[36]。

2.7 ETS-1

ETS-1(E26 transformation specific 1,ETS-1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，可通過對骨橋蛋白和黏蛋白等細胞外基質(zhì)(extracellular mtrix,ECM)合成相關(guān)基因的調(diào)控，在血管形成中起重要作用；還可調(diào)節(jié)細胞黏附力、細胞外基質(zhì)蛋白降解、細胞低氧耐受等多個環(huán)節(jié)。低氧條件下HIF-1α抑制內(nèi)皮素-1啟動子結(jié)合復合物，誘導ETS-1表達，進而提升了細胞對低氧的耐受力，使細胞生存、適應(yīng)等一系列的生物學反應(yīng)[37]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，低氧條件下HIF-1α的激活誘導了ETS-1的表達，進而促使新血管的生成，因此ETS-1參與血管生成、細胞黏附力調(diào)節(jié)、細胞外基質(zhì)蛋白降解和調(diào)節(jié)細胞低氧耐受等過程[38]。

2.8 胰島素樣生長因子-2

胰島素樣生長因子-2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)在細胞有絲分裂的過程中起重要作用，IGF-2表達刺激細胞的增殖，并參與DNA復制和轉(zhuǎn)錄。IGF-2在大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達量非常高，與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。IGF-2抑制細胞凋亡，進一步使組織器官生長、分化得到促進。研究表明，在體外低氧無血清的條件下，可誘導心肌細胞中IGF-2表達升高[39]。有報道指出，IGF-2是調(diào)節(jié)胚胎的生長因子[40]。IGF-2基因的表達在動物胚胎發(fā)育、脂肪沉積、骨骼與神經(jīng)發(fā)育、細胞增殖分裂及調(diào)控轉(zhuǎn)化等方面具有極顯著的作用[41]。

2.9 β-連環(huán)素

Wnt/β-catenin是Wnt經(jīng)典途徑，β-連環(huán)素(β-catenin)是Wnt信號通路中重要因子。低氧通過HIF-1α中樞信號激活Wnt/β-catenin通路，同時Wnt/β-catenin通路反調(diào)控HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，作用于下游的基因。有學者指出，在低氧培養(yǎng)骨肉瘤細胞體外增殖的研究證實了Wnt/β-catenint通路被低氧激活，進而調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子的激活，使細胞異常增殖，說明低氧條件下細胞的增殖可能與HIF-1α經(jīng)β-catenin激活Wnt通路誘導下游基因有關(guān)[42]。Wnt/β-catenin也可調(diào)控HIF-1α的轉(zhuǎn)錄，干擾β-catenin后，HIF-1α的表達明顯降低，Wnt/β-catenin和HIF-1α互相調(diào)節(jié)以適應(yīng)低氧微環(huán)境的變化進而影響細胞增殖。

2.10 絲裂原活化蛋白激酶

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 是胞內(nèi)的一類蛋白激酶，主要介導細胞反應(yīng)的重要信號系統(tǒng)及參與細胞的很多生長過程。低氧應(yīng)激能誘導MAKP的家族成員的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)磷酸化使細胞生長。ERK的上游調(diào)控因子絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Raf的N-端結(jié)構(gòu)域與ERK結(jié)合并激活，使得ERK磷酸化，從而提高HIF-1α的表達水平[43]。余治國等[44]研究表明，下調(diào)HIF-1α抑制了細胞內(nèi)MAPK/ERK通路，且抑制了細胞的和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。在HIF-1α和MAPK共同調(diào)控低氧肝星狀細胞的活化刺激的研究中證實MAPK/ERK信號通路對HIF-1α的活性至關(guān)重要，包括HIF-1α的泛素化的減弱以及核易位的促進，從而使HIF-1α進入細胞核作為轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下調(diào)節(jié)細胞的存活[45]。

2.11 SENP1

SENP1是小類泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)，HIF-1α靶蛋白被SUMO化修飾，其活性受到抑制，HIF-1α的穩(wěn)定性增加[46-47]。在低氧條件下SENP1調(diào)節(jié)HIF-1α的研究中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α誘導SENP1表達，反之SENP1使HIF-1α去SUMO化，進而形成正反饋回路，在低氧條件下穩(wěn)定HIF-1α[48]。目前已確定低氧條件下SENP1是HIF-1α積累的關(guān)鍵因子，SENP1通過穩(wěn)定HIF-1α來調(diào)節(jié)細胞的低氧適應(yīng)性，如低氧條件下SENP1與HIF-1α的反饋回路能調(diào)節(jié)細胞增殖[49]。在低氧維持肝竇內(nèi)皮細胞的研究中證實了這一觀點，通過SENP1/HIF-1α/VEGF信號通路促進細胞增殖[50]。還有研究證明低氧條件下HIF-1α通過SENP1介導泛素特異性蛋白酶28(USP28)去SUMO化，進一步在細胞中積聚HIF-1α，以SENP1-USP28-HIF-1α正反饋調(diào)節(jié)HIF-1α的濃度并增強其轉(zhuǎn)錄活性[47]。

3 小 結(jié)

低氧培養(yǎng)細胞有利于提高細胞的生長動力學及趨化因子受體的表達，在細胞培養(yǎng)過程中細胞增殖間期、干細胞分化能力顯著增加，且低氧能調(diào)節(jié)細胞中的氧化酶活性，使細胞中線粒體膜電位具有穩(wěn)定作用[11]。隨著低氧培養(yǎng)細胞的技術(shù)提高及檢測技術(shù)的先進，對于不同細胞的生物學特性與機制將會有更全面的認識。

在低氧條件下，HIF-1α調(diào)控激活因子使信號通路被激活，對下游轉(zhuǎn)錄因子及靶細胞因子進行調(diào)控，從而與其產(chǎn)生相互作用，促進細胞在低氧環(huán)境下的發(fā)生與發(fā)展，使因子具有轉(zhuǎn)錄活性。低氧條件下HIF-1α可調(diào)控靶細胞因子VEGF、EPO及PGK1，從而促進細胞的增殖，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ETS-1與IGF-2，使細胞具有低氧耐受及抗凋亡等作用[37,40]。HIF-1α介導Wnt/β-catenin、MAPK/ERK、TGF-β-PI3K/Akt-HIF-1α和SENP1/HIF-1α等信號通路影響細胞增殖及血管生成。HIMF主要對肺動脈平滑肌細胞的增殖、遷移具有刺激作用，參與肺部多種疾病的生理過程，能調(diào)節(jié)肺血管重塑相關(guān)的炎性細胞、因子等，它還具有促進血管新生及血管收縮等作用，從而進一步了解HIMF在低氧條件下是否是低氧肺部疾病的治療的一個靶點。HIF-1α與其他下游靶基因在分子水平及其他水平的進一步聯(lián)系是今后研究的重點，筆者對上述領(lǐng)域的研究成果進行了歸納與綜述，以期能在更高的水平下建立完善的低氧細胞傳導通路的信號網(wǎng)絡(luò)。