陳 肖，管紅梅，陳夢(mèng)林，王保山，代 敏，蒲忠慧, 2, 3*

基于指紋圖譜和多指標(biāo)成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地草果質(zhì)量

陳 肖1，管紅梅1＃，陳夢(mèng)林1，王保山4，代 敏2*，蒲忠慧1, 2, 3*

1. 成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500 2. 四川省動(dòng)物源性食品獸藥殘留防控技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500 3. 成都醫(yī)學(xué)院 發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610500 4. 北京生泰爾科技股份有限公司，北京 102600

采用指紋圖譜、多指標(biāo)成分定量與化學(xué)模式識(shí)別相結(jié)合的方法，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地草果質(zhì)量，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。采用HPLC法，流動(dòng)相為甲醇-0.2 mol/L磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，柱溫30 ℃，體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，對(duì)15批不同產(chǎn)地草果藥材建立指紋圖譜及6種有效成分含量測(cè)定，運(yùn)用聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）對(duì)草果進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別研究。建立了15批草果藥材的指紋圖譜，相似度為0.737～0.991，共標(biāo)定21個(gè)共有峰，指認(rèn)了6個(gè)成分，含量測(cè)定結(jié)果表明不同產(chǎn)地草果中化學(xué)成分含量存在明顯差異；HCA分析15批草果明顯分為3類；PCA得到4個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.941%；OPLS-DA表明原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸可能是影響草果藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物。建立的草果HPLC指紋圖譜及6個(gè)成分含量測(cè)定方法的專屬性強(qiáng)，且準(zhǔn)確、可靠，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別可用于草果的藥材鑒別和質(zhì)量控制。

草果；指紋圖譜；多指標(biāo)成分；化學(xué)模式識(shí)別；質(zhì)量評(píng)價(jià)；原兒茶酸；原兒茶醛；對(duì)羥基苯甲酸

草果為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果-Crevost et Lemaire的干燥成熟果實(shí)，主要分布于貴州、廣西、云南等地?，F(xiàn)代研究表明其含有揮發(fā)油、黃酮類、酚酸類、甾體類以及二苯庚烷類等化學(xué)成分[1-6]，具有燥濕溫中、截瘧除痰之功效。草果的質(zhì)量評(píng)價(jià)目前主要側(cè)重于外觀品質(zhì)以及揮發(fā)油含量指標(biāo)等項(xiàng)目[7]，但不足以說(shuō)明草果的內(nèi)在品質(zhì)，更不能對(duì)草果質(zhì)量從整體上進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。指紋圖譜作為整體、穩(wěn)定的化學(xué)鑒別手段，是當(dāng)今國(guó)際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的質(zhì)控模式[8]。隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展以及中藥質(zhì)量控制要求的提高，多指標(biāo)成分含量測(cè)定已成為中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵[9-10]。因此，本研究采用指紋圖譜與多指標(biāo)含量測(cè)定相結(jié)合的方法，同時(shí)結(jié)合聚類分析（cluster analysis，HCA）、主成分分析主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判別分析正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等化學(xué)模式識(shí)別綜合分析各主產(chǎn)區(qū)草果藥材的成分差異，明確其產(chǎn)地差異及成分特征，為草果藥材的鑒別及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（G7114A 1260 VWD Detector，LC-1260 2.4.0.628色譜工作站，美國(guó)Agilent公司）；ME204型萬(wàn)分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SB25-12D超聲波清洗儀（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；MiLi-Q純水儀（美國(guó)milipore公司）。

1.2 材料

原兒茶醛（批號(hào)PS020016）、對(duì)羥基苯甲酸（批號(hào)PS010279）對(duì)照品均購(gòu)自成都普思生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%。原兒茶酸（批號(hào)MUST-20110310）、龍膽酸（批號(hào)MUST-20082605）、香草酸（批號(hào)MUST-20072701）、對(duì)羥基苯丙酸（批號(hào)MUST-20091902）對(duì)照品均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；甲醇（色譜級(jí)，Sigma公司）；其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

共收集草果藥材15批，分別來(lái)自主產(chǎn)區(qū)貴州（5批）、廣西（5批）和云南（5批）等地。所有藥材經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李羿教授鑒定為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果-Crevost et Lemaire的干燥成熟果實(shí)。具體信息詳見表1。

表1 草果藥材來(lái)源信息

Table 1 Sources of medicinal materials of A. tsao-ko

編號(hào)產(chǎn)地來(lái)源收集時(shí)間 S1貴州水城北京時(shí)珍堂2020-10 S2貴州畢節(jié)北京時(shí)珍堂2020-10 S3貴州納雍北京時(shí)珍堂2020-10 S4貴州鎮(zhèn)寧北京時(shí)珍堂2020-10 S5貴州三穗北京時(shí)珍堂2020-10 S6廣西那坡自采2019-10 S7廣西南寧自采2019-10 S8廣西橫縣自采2019-10 S9廣西靈山自采2019-10 S10廣西桂林自采2019-10 S11云南紅河滇本草藥業(yè)2020-09 S12云南怒江滇本草藥業(yè)2020-09 S13云南盈江滇本草藥業(yè)2020-09 S14云南文山滇本草藥業(yè)2020-09 S15云南騰沖滇本草藥業(yè)2020-09

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為0.2 mol/L磷酸水溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫：0～5 min，10%～15% B；5～10 min，15%～20% B；10～30 min，20%～40% B；30～40 min，40%～60% B；40～50 min，60%～70% B；50～60 min，70%～80% B。體積流量1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取草果粉末（過(guò)二號(hào)篩）約5.0 g，精密稱定。置具塞三角瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放至室溫，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量、搖勻，0.45m微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得[11]。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱定原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、香草酸、對(duì)羥基苯丙酸對(duì)照品適量，加入甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為3.45、1.46、4.72、107.83、5.61、54.36 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.2.3 空白溶液 以樣品的提取溶劑（70%乙醇）作為空白溶液。

2.4 指紋圖譜的建立及分析

2.4.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取草果藥材粉末（S2）約5 g（過(guò)二號(hào)篩），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.1.1項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以10號(hào)峰（對(duì)羥基苯丙酸）為參照峰（S，該峰分離良好，保留時(shí)間合適），計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.39%，相對(duì)峰面積RSD均小于1.18%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一草果藥材粉末（S2）約5 g（過(guò)二號(hào)篩），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以10號(hào)峰對(duì)羥基苯丙酸為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.67%，相對(duì)峰面積RSD均小于1.84%，表明方法重復(fù)性好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一草果供試品溶液，按“2.1.1項(xiàng)下”色譜條件測(cè)定，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，以10號(hào)峰對(duì)羥基苯丙酸為參照峰（S），計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.83%，相對(duì)峰面積RSD均小于1.48%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 精密稱取15批草果粉末各5.0 g，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，然后分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將15批草果樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2008A版）》中，以S11號(hào)樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.5 min中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜（R），經(jīng)多點(diǎn)校正后進(jìn)行色譜峰匹配生成樣品疊加指紋圖譜（圖1）；然后以對(duì)照指紋圖譜為參照，進(jìn)行各樣品圖譜的相似度評(píng)價(jià)。同時(shí)，通過(guò)將對(duì)照指紋圖譜與對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)。結(jié)果，15批草果樣品中共標(biāo)定了21個(gè)共有峰；通過(guò)與對(duì)照品色譜圖比對(duì)，指認(rèn)了其中6個(gè)成分，分別為原兒茶酸（3號(hào)峰）、原兒茶醛（4號(hào)峰）、對(duì)羥基苯甲酸（5號(hào)峰）、龍膽酸（6號(hào)峰）、香草酸（8號(hào)峰）、對(duì)羥基苯丙酸（10號(hào)峰）。各樣品圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.737～0.991，說(shuō)明15批草果樣品具有很高的相似性，相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表2。

圖1 15批草果樣品的HPLC疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）

表2 15批草果樣品HPLC指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

Table 2 HPLC fingerprint similarity evaluation results of 15 batches of A. tsao-ko

編號(hào)S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15R S11.000 S20.9771.000 S30.9120.8621.000 S40.8240.8140.8221.000 S50.9860.9880.8890.8341.000 S60.9320.9610.8240.8230.9681.000 S70.8240.8590.7710.8200.8630.9241.000 S80.7520.7940.7390.7960.8200.8920.9371.000 S90.8030.7600.7770.7630.7830.8720.9270.9911.000 S100.7730.8440.7720.7650.8510.9290.9150.9400.9491.000 S110.7370.8250.8830.8580.8240.8780.8040.8330.8480.9491.000 S120.8410.8950.7640.8020.9090.9430.8920.9230.9230.9680.9441.000 S130.7530.8510.8330.8990.8240.8640.7500.8090.8230.8710.9340.8571.000 S140.8930.9400.7810.8210.9490.9710.9010.8970.8890.9550.9240.9770.8921.000 S150.8190.8990.8730.8860.8010.7560.8090.8150.8140.8520.8770.8800.8280.7901.000 R0.9350.9600.8700.8840.9710.9810.9340.9810.8940.9330.8780.9650.8310.9760.7901.000

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 HCA 采用多元統(tǒng)計(jì)分析軟件SIMCA-P 14.0對(duì)15批樣品中21個(gè)共有峰的標(biāo)準(zhǔn)化峰面積聚類分析，樣品被分為3類：第一類為S8、S13～S15；第2類為S2；第3類為S1、S3～S7、S9～S12。HCA結(jié)果表明不同產(chǎn)區(qū)草果藥材的質(zhì)量存在一定地域差異性，廣西和貴州的大部分草果具有一定的相似性。

2.5.2 PCA 進(jìn)一步探討3個(gè)主產(chǎn)區(qū)草果化學(xué)成分之間的差異，將15批樣品21個(gè)共有峰的峰面積導(dǎo)入SPSS.26軟件進(jìn)行PCA分析，計(jì)算相關(guān)矩陣的特征值及其方差貢獻(xiàn)率[12]。以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到草果藥材指紋圖譜共有峰特征值（表3），4個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)到85.941%，說(shuō)明4個(gè)主成分在反映3個(gè)主產(chǎn)地草果樣品共有成分關(guān)系中起到主導(dǎo)作用。其中第1～4個(gè)主成分貢獻(xiàn)率分別為為45.632%、18.466%、12.320%和9.523%。由主成分矩陣（表4）可知各個(gè)共有峰對(duì)4個(gè)主成分不同的獨(dú)立方差貢獻(xiàn)率，第1主成分主要代表了峰1、2、4、5、9、10、12；第2主成分主要代表了峰3、15、20、21；第3主成分代表了峰8、11；第4主成分代表了峰17、19。

2.5.3 OPLS-DA 在PCA的基礎(chǔ)上進(jìn)一步選擇有監(jiān)督模式的OPLS-DA對(duì)不同產(chǎn)區(qū)15份草果樣品進(jìn)行分析，篩選出對(duì)引起組間差異貢獻(xiàn)率較大的成分。在建立的OPLS-DA模型中，累計(jì)解釋能力參數(shù)2和2分別為0.712、0.744，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（2）為0.916，提示本實(shí)驗(yàn)所建立OPLS-DA模型的穩(wěn)定性及預(yù)測(cè)能力較好[13]。由OPLS-DA得分圖2可知，不同批次樣品可分為3類，貴州和廣西大部分樣品可以聚為一類，與HCA結(jié)果一致。貴州和廣西位置毗鄰，環(huán)境氣候條件具有更多的相似性，均屬于亞熱帶氣候區(qū)。對(duì)3組數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行整體分析變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP）。VIP是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，值越大，表明該色譜峰的貢獻(xiàn)越大[14]。在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，提取模型中21個(gè)變量的VIP，見圖3。選取VIP＞1的14個(gè)化合物作為差異性標(biāo)志物，按VIP大小排序依次為20號(hào)峰＞15號(hào)峰＞3號(hào)峰（原兒茶酸）＞4號(hào)峰（原兒茶醛）＞2號(hào)峰＞9號(hào)峰＞5號(hào)峰（對(duì)羥基苯甲酸）＞10號(hào)峰（對(duì)羥基苯丙酸）＞21號(hào)峰＞1號(hào)峰＞7號(hào)峰＞19號(hào)峰＞12號(hào)峰＞13號(hào)峰，這些成分是區(qū)分不同產(chǎn)地草果差異的主要標(biāo)志性物質(zhì)，在將來(lái)的研究中建議多關(guān)注。

表3 15批草果樣品主成分特征值及貢獻(xiàn)率

Table 3 Characteristic value and contribution rate of 15 batches of A. tsao-ko

主成分特征值方差貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/% 19.58345.63245.632 23.87818.46664.098 32.58712.32076.418 42.0009.52385.941

表4 15批草果樣品共有峰成分矩陣

Table 4 Component matrix of common peaks of 15 batches of A. tsao-ko

峰號(hào)共有峰主成分 1234 1未指認(rèn) 0.901 0.256?0.048?0.152 2未指認(rèn) 0.965 0.090?0.116 0.011 3原兒茶酸?0.272 0.860?0.253?0.272 4原兒茶醛 0.936 0.279?0.065 0.017 5對(duì)羥基苯甲酸 0.964 0.057?0.183 0.132 6龍膽酸 0.802?0.119 0.224 0.456 7未指認(rèn) 0.804 0.458?0.017?0.102 8香草酸?0.313 0.146 0.838?0.075 9未指認(rèn) 0.927 0.277?0.050 0.089 10對(duì)羥基苯丙酸 0.930 0.192?0.111?0.036 11未指認(rèn)?0.557 0.233 0.605?0.425 12未指認(rèn) 0.887 0.066 0.405 0.038 13未指認(rèn) 0.049?0.781 0.249 0.461 14未指認(rèn) 0.601 0.000 0.544?0.437 15未指認(rèn)?0.103 0.808?0.101 0.258 16未指認(rèn) 0.077 0.564 0.512 0.190 17未指認(rèn) 0.114 0.402 0.500 0.610 18未指認(rèn)?0.019?0.285 0.487 0.097 19未指認(rèn)?0.579 0.203?0.232 0.643 20未指認(rèn)?0.685 0.593 0.009 0.387 21未指認(rèn)?0.743 0.592 0.026?0.140

圖2 15批草果藥材正交偏最小二乘判別分析得分圖

2.6 含量測(cè)定

2.6.1 專屬性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液、混合對(duì)照品溶液以及空白溶液，0.45 μm濾膜濾過(guò)，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，各待測(cè)成分的色譜峰與相鄰色譜峰間的分離度均大于1.5，以各成分計(jì)的理論板數(shù)均在6000以上，且空白溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，說(shuō)明此方法專屬性良好。專屬性試驗(yàn)的HPLC色譜圖見圖4。

圖3 15批次草果21個(gè)共有峰VIP值

2.6.2 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液適量，用甲醇稀釋制成系列濃度的混合對(duì)照品溶液溶液。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，結(jié)果，各待測(cè)成分均在其相應(yīng)質(zhì)量范圍內(nèi)與其峰面積的線性關(guān)系良好（均不低于0.999 1），見表5。

3-原兒茶酸 4-原兒茶醛 5-對(duì)羥基苯甲酸 6-龍膽酸 8-香草酸 10-對(duì)羥基苯丙酸

表5 草果藥材中6個(gè)成分線性關(guān)系考察

Table 5 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges of six components of A. tsaoko

成分回歸方程r線性范圍/μg 原兒茶酸Y＝2 795.2 X－92.9840.999 20.004～4.000 原兒茶醛Y＝6 255.5 X－169.840.999 10.003～3.000 對(duì)羥基苯甲酸Y＝5 863.9 X－63.0620.999 30.004～4.000 龍膽酸Y＝44.433 X＋4.42120.999 40.400～4.000 香草酸Y＝6 407.7 X－151.940.999 70.004～4.000 對(duì)羥基苯丙酸Y＝503.17 X＋80.8030.999 30.200～4.000

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。計(jì)算得到原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、香草酸、對(duì)羥基苯丙酸峰面積的RSD分別為0.94%、1.18%、0.83%、0.68%、1.04%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一產(chǎn)地（S8）的草果粉末1.0 g，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定6次，記錄峰面積并按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中6種成分含量。結(jié)果，原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、香草酸、對(duì)羥基苯丙酸含量的RSD分別為1.13%、0.81%、1.14%、0.90%、0.61%、1.84%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取草果供試品溶液（S8）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、香草酸、對(duì)羥基苯丙酸峰面積的RSD分別為RSD分別為1.13%、0.79%、1.19%、1.09%、0.98%、1.48%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的草果樣品（S8）9份，分別按已知含量的50%、100%、150%加入各對(duì)照品（按“2.3”項(xiàng)下方法制備），再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、香草酸、對(duì)羥基苯丙酸的平均加樣回收率分別為95.43%、97.57%、95.05%、97.28%、97.13%、95.76%，RSD分別為1.97%、1.75%、2.35%、2.69%、1.84%、2.36%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.6.7 樣品含量測(cè)定 精密稱取15批不同產(chǎn)地草果藥材粉末（過(guò)二號(hào)篩）1.0 g，分別按“2.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算6種有效成分含量，結(jié)果見表6，可見不同產(chǎn)地草果化學(xué)成分含量存在明顯差異。通過(guò)含量測(cè)定結(jié)果箱線圖分析（圖5），可明確各產(chǎn)地草果中代表性化學(xué)成分。原兒茶酸在云南怒江（S12）采收的草果中含量最高，達(dá)到0.132 8 mg/g，云南騰沖（S15）則為最低；云南草果原兒茶醛和對(duì)羥基苯甲酸含量均在0.031 8和0.032 2 mg/g以上，整體高于其他產(chǎn)地，可作為區(qū)分云南草果與其他產(chǎn)地草果的2個(gè)指標(biāo)成分；云南草果龍膽酸量在1.589 6～3.421 3 mg/g，整體高于其它產(chǎn)區(qū)，也可作為區(qū)分云南草果與其他產(chǎn)地草果的差異性成分；云南產(chǎn)區(qū)的香草酸含量相對(duì)較高，云南怒江含量最高，達(dá)0.048 1 mg/g；貴州產(chǎn)區(qū)對(duì)羥基苯丙酸的含量明顯高于其它產(chǎn)區(qū)，可作為區(qū)分貴州草果與其他產(chǎn)地草果的差異性成分。廣西草果龍膽酸和對(duì)羥基苯丙酸含量整體偏低。

3 討論

本研究選擇貴州、廣西、云南3個(gè)草果主產(chǎn)區(qū)15批樣品，以指紋圖譜質(zhì)量控制模式定性，多指標(biāo)質(zhì)量控制模式定量，結(jié)合結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別全面評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地草果的質(zhì)量。結(jié)果表明15批草果藥材指紋圖譜的相似度在0.737～0.991，確定21個(gè)共有峰，指認(rèn)了6個(gè)成分。通過(guò)HCA、PCA和OPLS-DA等化學(xué)計(jì)量法分析表明15批草果樣品明顯分為3類，4個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.941%；通過(guò)變量權(quán)重要性排序發(fā)現(xiàn)共有峰20、15、2、9、10（對(duì)羥基苯丙酸）、5（對(duì)羥基苯甲酸）、1、21、3（原兒茶酸）、7、19、12，這些成分可作為區(qū)分和鑒別不同產(chǎn)區(qū)草果藥材質(zhì)量的主要標(biāo)志性成分，未知差異成分本課題組后續(xù)將會(huì)繼續(xù)深入研究，以期為評(píng)價(jià)草果藥材質(zhì)量提供更為全面地參考。

表6 草果中6個(gè)成分的含量測(cè)定

Table 6 Contents determination of six components of A. tsao-ko

編號(hào)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g?1) 原兒茶酸原兒茶醛對(duì)羥基苯甲酸龍膽酸香草酸對(duì)羥基苯丙酸 S10.066 90.029 40.022 61.627 40.035 72.404 7 S20.074 10.030 40.023 51.861 70.037 31.603 3 S30.076 80.029 90.023 42.047 30.038 62.077 1 S40.078 80.029 70.028 12.343 70.040 72.260 0 S50.071 40.029 70.024 31.556 70.035 21.057 8 S60.081 60.032 10.030 60.806 40.035 90.950 9 S70.074 90.030 70.048 91.212 10.040 21.460 0 S80.062 90.031 30.031 10.820 30.036 80.409 1 S90.055 30.031 30.027 41.069 90.037 50.400 7 S100.069 70.029 70.024 20.535 40.032 61.412 9 S110.080 50.031 80.036 71.990 20.038 22.124 7 S120.132 80.037 50.046 13.421 30.048 10.357 3 S130.107 70.034 60.036 12.386 50.041 01.245 5 S140.071 80.031 90.032 21.589 60.035 41.502 3 S150.04380.031 80.033 41.710 00.036 30.903 9

圖5 HPLC指紋圖譜各指標(biāo)成分含量測(cè)定箱線圖

酚酸類化合物是草果一類重要化學(xué)成分，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[16]和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[11]表明草果中主要為苯甲酸為母核的C6-C1型酚酸類成分。其中原兒茶酸、原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、香草酸等酚酸類成分是草果發(fā)揮抗菌抗炎、抗氧化等作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[17-18]，因此本研究主要對(duì)草果中酚酸類成分進(jìn)行了含量測(cè)定。在流動(dòng)相選擇上發(fā)現(xiàn)0.2 mol/L的磷酸溶液比0.02 mol/L的稀磷酸溶液[11]色譜峰信息量多，響應(yīng)值更高。含量測(cè)定結(jié)果表明草果酚酸類成分具有明顯的產(chǎn)地差異。通過(guò)產(chǎn)地差異成分分析，明確了不同產(chǎn)地草果特征成分。云南草果原兒茶醛、對(duì)羥基苯甲酸和龍膽酸含量均整體高于廣西和貴州產(chǎn)區(qū)，可作為區(qū)分云南草果與其他產(chǎn)地草果的的3個(gè)差異性成分，貴州產(chǎn)區(qū)對(duì)羥基苯丙酸的含量明顯高于其它產(chǎn)區(qū)，可作為貴州草果的差異性成分，廣西草果龍膽酸和對(duì)羥基苯丙酸含量整體較低。

本研究所建立的不同產(chǎn)地草果HPLC指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法的專屬性較強(qiáng)，且準(zhǔn)確、可靠。結(jié)合指紋圖譜和酚酸類成分的定量研究，可以為區(qū)分草果的產(chǎn)地以及全面、準(zhǔn)確地控制草果的質(zhì)量提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 楊志清, 徐紹忠, 張薇, 等. 云南草果莖葉揮發(fā)油含量及主要化學(xué)成分分析 [J]. 中藥材, 2019, 42(2): 339-343.

[2] Hong S S, Lee J H, Choi Y H,. Amotsaokonal A-C, benzaldehyde and cycloterpenal from[J]., 2015, 56(48): 6681-6684.

[3] Kim J G, Jang H, Le T P L,. Pyranoflavanones and pyranochalcones from the fruits of[J]., 2019, 82(7): 1886-1892.

[4] 柳航, 王敏, 許耶, 等. 草果化學(xué)成分的研究 [J]. 中成藥, 2020, 42(10): 2648-2651.

[5] 趙雨鴻, 沈華, 代雙億, 等. 草果總黃酮的大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)化研究 [J]. 中國(guó)藥房, 2020, 31(7): 831-836.

[6] 李志君, 萬(wàn)紅焱, 顧麗莉, 等. 草果多酚物質(zhì)提取及LC-MS/MS分析 [J]. 食品工業(yè)科技, 2017, 38(8): 294-299.

[7] 中國(guó)藥典 [S]. 一部. 2020: 249-250.

[8] 劉東方, 趙麗娜, 李銀峰, 等. 中藥指紋圖譜技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用 [J]. 中草藥, 2016, 47(22): 4085-4094.

[9] 佘一鳴, 胡永慧, 韓立云, 等. 中藥質(zhì)量控制的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2017, 48(12): 2557-2563.

[10] 陳麗華, 肖發(fā)林, 黃詩(shī)雨, 等. 中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究思路及創(chuàng)新發(fā)展趨勢(shì) [J]. 中草藥, 2021, 52(9): 2541-2547.

[11] 任洪濤, 譚年文, 周恒蒼, 等. 高效液相色譜法測(cè)定草果中4種酚酸含量 [J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2021, 12(9): 3694-3699.

[12] 陳歡, 高萌, 羅小泉, 等. 不同產(chǎn)地枳殼藥材中12種有效成分的主成分分析和判別分析 [J]. 中草藥, 2019, 50(14): 3433-3437.

[13] 黃建猷, 胡筱希, 麥琬婷, 等. 指紋圖譜及多成分定量結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別法評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地消瘤藤質(zhì)量 [J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4334-4340.

[14] Gao S, Chen H G, Zhou X. Study on the spectrum-effect relationship of the xanthine oxidase inhibitory activity of[J]., 2019, 42(21): 3281-3292.

[15] 李強(qiáng), 杜思邈, 張忠亮, 等. 中藥指紋圖譜技術(shù)進(jìn)展及未來(lái)發(fā)展方向展望 [J]. 中草藥, 2013, 44(22): 3095-3104.

[16] 沈華, 管紅梅, 鐘燕, 等. 草果酚酸的提取工藝優(yōu)化 [J]. 中國(guó)藥房, 2021, 32(14): 1698-1702.

[17] 雷智冬, 黃鎖義. 草果提取方法、生物活性與臨床應(yīng)用研究新進(jìn)展 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2021, 39(1): 245-249.

[18] Kumar N, Goel N. Phenolic acids: Natural versatile molecules with promising therapeutic applications [J]., 2019, 24: e00370.

Quality evaluation of-from different habitats by fingerprint combined with multi-component quantification and chemical pattern recognition

CHEN Xiao1, GUAN Hong-mei1, CHEN Meng-lin1, WANG Bao-shan4, DAI Min2, PU Zhong-hui1, 2, 3

1. School of Laboratory Medicine, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China 2. Sichuan Engineering Laboratory for Prevention and Control Technology of Veterinary Drug Residue in Animal-origin Food, Chengdu 610500, China 3. Sichuan Key Laboratory of Development and Regeneration, Chengdu Medical College, Chengdu 610500, China 4. Beijing Centre Biology Co., Ltd., Beijing 102600, China

Based on the method of HPLC fingerprint, multi-component quantification and chemical pattern recognition, the quality of-from different habitats was evaluated to provide basis for further development and utilization.The methanol-0.2 mol/L phosphoric acid aqueous solution was used as mobile phase in HPLC analysis with gradient elution for the fingerprint establishment of-from different habitats and the determination of six effective components. The detection wavelength was set at 270 nm, the flow rate was 1.0 mL/min, the injection volume was 10 μL, and the column temperature was 30 ℃. The combination of hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) were employed to distinguish the quality of 15 batches of-from different producing areas.The fingerprint of 15 bathes of-were established and the similarity were 0.737—0.991, a total of 21 common peaks were calibrated and six of them were identified by comparing with reference subslances; The content determination results showed that there were obvious differences in the content of chemical components of-from different habitats; The results of HCA demonstrated that there were obvious three categories distinctions; PCA analysis indicated that the cumulative variance contribution rate of four principal components were 85.941%; OPLS-DA found protocatechuic acid, protocatechualdehyde and-hydroxybenzoic acid may be the markers of quality difference between them.The established fingerprint and the content determination method of the six components were highly specific, accurate and reliable. Furthermore, combined with chemical pattern recognition, it could be used for the identification and over all quality control of-

-Crevost et Lemaire; fingerprint; multiple index components; chemical pattern recognition; quality evaluation; protocatechuic acid; protocatechualdehyde;-hydroxybenzoic acid

R286.2

A

0253 - 2670(2022)11 - 3472 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.025

2021-12-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31970137，82102442）；四川省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2021YJ0158，2020JDRC0071）；四川省省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202113705988）；成都醫(yī)學(xué)院發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究基金資助項(xiàng)目（SYS19-08）

陳 肖（2001—），男，四川漢源人，在讀?？疲饕獜氖轮兴庂|(zhì)量分析。E-mail: 1096362973@qq.com

代 敏（1974—），女，四川達(dá)州人，博士，教授，主要從事中藥抗耐藥菌機(jī)制研究。E-mail: daimin1015@163.com

蒲忠慧（1982—），女，四川萬(wàn)源人，博士，副教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: zhonghui.pu@163.com

#共同第一作者：管紅梅（1996—），女，四川資陽(yáng)人，在讀本科，主要從事中藥質(zhì)量分析。E-mail: 2665330168@qq.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]