李亞偉，劉增才，孫婷婷，烏木提·巴合提別克，鄒 莉*

暴馬桑黃細胞色素P450家族基因克隆及表達分析

李亞偉1，劉增才1，孫婷婷2，烏木提·巴合提別克1，鄒 莉1*

1. 東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 哈爾濱學院食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150086

為深入了解細胞色素P450家族基因在暴馬桑黃生長發(fā)育調控中的功能。采用PCR技術獲得目的基因的cDNA序列全長，通過生物信息學在線軟件分析其編碼的氨基酸序列；采用同源重組的方法構建原核表達載體；采用熒光定量PCR技術分析其不同發(fā)育階段的表達特性。暴馬桑黃中克隆得到的基因開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列全長1758 bp，編碼585個氨基酸，相對分子質量為66 080，經國際P450命名委員會命名為；跨膜區(qū)預測表明CYP5150AW6蛋白不具有跨膜結構；亞細胞定位顯示CYP5150AW6蛋白在細胞質和線粒體中修飾合成；系統(tǒng)進化分析結果表明，暴馬桑黃CYP5150AW6蛋白與靈芝CYP5150L8蛋白親緣關系最近，符合物種分類原則；SDS-PAGE結果證實在75 000～100 000出現目的蛋白條帶（包含20 000的標簽蛋白），說明所獲得的基因能夠成功表達出蛋白；從熒光定量分析結果中可以看出基因轉錄水平從菌絲體階段到子實體階段生長逐漸升高，并且在子實體階段達到最高，說明該基因可能與暴馬桑黃的生長發(fā)育相關。通過對基因的鑒定與分析，為進一步研究該基因在暴馬桑黃生長發(fā)育調控過程的功能提供了理論依據。

暴馬桑黃；細胞色素P450基因；生長發(fā)育；表達分析；熒光定量PCR

桑黃是一種非常珍貴且具有廣闊研究與開發(fā)價值的藥用真菌，因被發(fā)現多寄生在桑樹的枝干上，子實體顏色為黃褐色，故而得名，民間也稱桑臣、桑耳等[1]。桑黃是一類傳統(tǒng)的藥用真菌，東漢時期《神農本草經》中記載：“桑耳，黑者，主女子漏下赤白汁，血病癥瘕積聚，陰痛，陰陽寒熱無子?！鄙６礊樯｜S?！吧｜S”一詞最初出現在隋唐時期甄權編著的《藥性論》中，把桑耳與“桑黃”合二為一，并首次記載桑黃藥性平，無毒[2]。桑黃有“森林軟黃金”的美稱，近年來由于諸多文獻報道，桑黃在抗腫瘤、降血糖、抗氧化、增強免疫力等方面具有良好的效果，且不會出現不良反應，因此受到廣大消費者的喜愛和追捧[3]。桑黃中的三萜、黃酮、多糖、酚類等化合物是其發(fā)揮藥用效果的主要活性成分[4]。藥用真菌中活性成分的含量和生物合成途徑中相關基因的表達量有著密切的聯系，隨著分子生物學技術的不斷進步與發(fā)展，使用現代生物技術對藥用真菌的功能基因進行鑒定已成為目前研究的熱點。

細胞色素P450（CYP450）是廣泛存在于動物、植物、真菌及細菌中的含有血紅素和硫羥基的多功能蛋白[5]。其功能大致可分為2類：一是參與催化激素、脂肪酸、甾醇類及萜類化合物等一些具有重要功能的內源物質的生物合成代謝過程[6]；如研究證明桑黃[4, 7-8]、靈芝[9-12]、茯苓[13]、豬苓[14]等藥用真菌中部分細胞色素P450基因能參與萜類及甾醇類化合物的合成。二是參與多種外源物質的生物氧化過程，如除草劑、殺蟲劑、藥物及有毒物質等，如青霉菌[15]解磷能力及白腐真菌[16-17]對有機污染物和農業(yè)廢棄物的降解作用。目前，對真菌基因功能的研究多集中于萜類及甾醇類化合物的生物合成代謝過程，而對于激素的合成代謝以及生長調控相關基因的研究相對較少，但在植物中有研究證明CYP450能參與生物體的生長調控，楊杰等[18]發(fā)現白樺、及3個基因具有組織特異性和激素誘導表達特異性，在白樺的生長發(fā)育和抵御脅迫中起著重要作用。

目前，對于暴馬桑黃中基因的研究報道相對較少。本實驗以一種生長于暴馬丁香樹上的桑黃—暴馬桑黃(Pilát) L. W. Zhou & Y. C. Dai為研究對象。通過克隆暴馬桑黃CYP450家族的基因，并對其進行生物信息學分析以及不同發(fā)育階段的基因表達水平分析，豐富對暴馬桑黃CYP450基因功能的研究，同時為進一步研究該基因在暴馬桑黃生長調控中的作用奠定基礎。

1 材料與試劑

1.1 材料

試驗所用的菌株為暴馬桑黃菌種DL101（登錄號為KP974834）、大腸桿菌克隆菌株DH5α、表達菌株BL21（DE3）和原核表達載體pET-32a（+）均保藏于東北林業(yè)大學森林保護學科實驗室。

1.2 試劑

QuickCutR I、QuickCutd III、PremixTaq 酶、TB Green? Premix Ex Taq? II（Tli RNaseHPlus）、5×In-Fusion HD 試劑盒、PrimeScript II 1stStrand cDNA Synthesis Kit 和PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）均從大連Takara公司購買得到。植物總RNA提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購于北京天根生化公司。質粒提取試劑盒購于上海Omega公司。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS- PAGE）試劑盒購買于北京索萊寶公司。

2 方法

2.1 試驗引物

本實驗中所用到的引物序列如表1所示。

2.2 CYP5150AW6基因克隆

暴馬桑黃菌絲體總RNA使用植物總RNA提取試劑盒進行提取，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用分光光度計檢測其濃度和質量，然后快速反轉錄為cDNA。之后用cDNA作為模板，以-F1、-R1（表1）作為引物進行PCR擴增。PCR擴增的產物經凝膠電泳檢測后，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進行純化回收，再用瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產物的濃度，并送哈爾濱擎科生物有限公司進行測序。

2.3 CYP5150AW6基因序列分析

測序結果提交到NCBI，并對目的基因序列進行開放閱讀框（open reading frame，ORF）和保守結構域預測；利用生物信息學軟件預測和分析基因編碼的氨基酸序列：用ProtParam軟件預測目的蛋白的理化性質；用紐普生物在線工具預測目的蛋白的跨膜區(qū)；用SignalP 5.0 sever預測目的蛋白的信號肽；用PSORT II預測目的蛋白的亞細胞定位；用SOPMA和SWISS-MODEL分別預測目的蛋白的二級結構和三級結構；用MEGA 5.2.2預測目的蛋白系統(tǒng)進化關系[7, 19-21]。

表1 引物序列與預測片段大小

Table 1 Primer sequences and predicted fragment size

引物名稱引物序列（5’-3’）預測片段大小/bp CYP5150AW6-F1（PCR）AAACGGCCAATGGAATTGTCTA1800 CYP5150AW6-R1TGTGTCACAACTTCTCCTCGAGTG CYP5150AW6-F2（PCR）TATCGGATCCGAATTCATGGAATTGTCTACCGCCGGG1790 CYP5150AW6-R2GTGCGGCCGCAAGCTTTCACAACTTCTCCTCGAGTGC pET-32a-F (RT-PCR)TAATACGACTCACTATAGGG 712 pET-32a-RGCTAGTTATTGCTCAGCGG CYP5150AW6-F3（qRT-PCR）CACTCGGGGACCATCACCGCAAACA 155 CYP5150AW6-R3GTCAAACTCCTTCGTCCCACCTCGC a-tubulin-F (qRT-PCR)CCAGCAAGCGTTACCGATT 129 α-tubulin-RTCCACGACGTCCATCGTTC

下劃線部分表示同源臂

The underlined part represents the homologous arm

2.4 CYP5150AW6基因原核表達載體構建

以-F1、-R1為引物擴增產物，純化回收得到DNA，以DNA模板，以F2R2為引物，通過PCR得到基因開放閱讀框。用限制性內切酶R I和d III對pET-32a質粒進行雙酶切，酶切產物純化回收后，用In-Fusion HD試劑盒將其與基因ORF進行同源重組，得到pET-32a-重組質粒，隨后轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。從轉化后的大腸桿菌中提取質粒，用引物pET-32a-F、pET-32a-R（表1）進行PCR檢測。之后，將PCR檢測結果中顯示陽性的質粒送哈爾濱擎科生物公司測序。

2.5 CYP5150AW6基因誘導表達及檢測

將檢測結果中正確的pET-32a-質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞后進行菌落PCR檢測，將陽性菌落接種到LB液體培養(yǎng)基（含Amp質量濃度為100 μg/mL）中37 ℃過夜振蕩培養(yǎng)，取50 μL菌液加入新鮮LB液體培養(yǎng)基（含Amp質量濃度為100 μg/mL）中振蕩培養(yǎng)，當600達到0.6～0.8時收集陰性對照菌液，在剩余的菌液中加入 IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導表達，收集不同誘導時間段的菌液進行SDS-PAGE檢測。

2.6 熒光定量檢測

將長滿培養(yǎng)皿的暴馬桑黃菌株接種至PD液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，分別收集6、8、10、12和14 d的菌絲。同時將暴馬桑黃菌株接種到栽培袋中，收集原基和子實體[8]。將收集得到的暴馬桑黃材料利用植物總RNA提取試劑盒，分別提取總RNA，之后，利用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA，以基因作為內參，每組設置3個重復。在核酸擴增熒光檢測儀上進行qRT-PCR反應，反應程序：95 ℃、3 min；95 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min，40個循環(huán)；95 ℃、10 s，55 ℃、30 s，95 ℃、30 s。根據得到的不同t值，按照公式2?ΔΔCt對暴馬桑黃不同發(fā)育階段基因相對轉錄水平進行計算[22]。

經過單因素分析結果表明，激勵信號的幅值越大，檢測效果越好；不同的激勵信號頻率對柴油凝點的檢測區(qū)別不大，但考慮到頻率是影響阻抗的重要因素之一，因此，對其進行下一步的正交試驗考察。

3 結果與分析

3.1 CYP5150AW6基因全長獲得

以暴馬桑黃菌絲總RNA反轉錄得到的cDNA作為模板，使用所設計的引物在1000～2000 bp擴增出單一的1條基因條帶，與預測目的基因大?。?800 bp）基本一致（圖1）。純化回收的產物送哈爾濱擎科生物公司測序。

3.2 生物信息學分析

3.2.1 理化性質預測 利用NCBI網站上的ORF Finder進行ORF查找，結果顯示基因序列中含有1個1758 bp的ORF，編碼585個氨基酸（圖2），具有P450超家族的PLN03195保守結構域（圖3）。ProtParam軟件分析結果表明，CYP5150AW6蛋白中亮氨酸的含量最高是11.3%，半胱氨酸的含量最低是0.5%，蛋白相對分子質量是66 080，分子式為C2994H4710N800O841S22，原子總數為9367，理論等電點為9.02，親水性的總平均值是?0.136，不穩(wěn)定系數為是38.52，說明CYP5150AW6蛋白是親水性的穩(wěn)定蛋白。

M-Marker 1-目的條帶

圖2 CYP5150AW6基因cDNA序列全長及其編碼的氨基酸序列

圖3 CYP5150AW6蛋白的結構域分析

3.2.2 CYP5150AW6蛋白跨膜區(qū)分析 跨膜區(qū)就是蛋白質序列中能夠跨越細胞膜的區(qū)域，多為α-螺旋結構，且多數由20～25個疏水性氨基酸構成?？缒^(qū)預測是判斷一個蛋白有無傳遞信號或物質的能力，對其功能的分析具有重要的意義[23]。使用紐普生物-在線工具-蛋白質跨膜區(qū)預測對CYP5150AW6蛋白進行預測分析，結果見圖4，表明此蛋白不具有跨膜結構。

圖4 CYP5150AW6蛋白的跨膜區(qū)預測結果

3.2.3 CYP5150AW6蛋白信號肽分析 信號肽是引導新合成的蛋白質分泌通路轉移的短肽鏈，序列長度多數為5～30個氨基酸[24]。使用SignalP 5.0 sever進行信號預測，結果顯示CYP5150AW6蛋白不存在信號肽（圖5）。

圖5 CYP5150AW6蛋白信號肽預測結果

3.2.4 CYP5150AW6蛋白亞細胞定位分析 蛋白質是構成細胞的基本有機物，是植物生命活動的物質基礎和主要體現者。蛋白質亞細胞的定位預測對蛋白質功能的研究具有重要的價值，更是生物信息學分析的重要環(huán)節(jié)，通過對蛋白質的亞細胞定位預測分析，有利于深入了解該蛋白的功能性值[25]。使用在線軟件PSORT II分析CYP5150AW6蛋白的亞細胞定位，結果顯示其主要定位于細胞質、線粒體、內質網、細胞核、高爾基體和過氧化物酶體，其依次比例大約為10∶6∶2∶2∶1∶1。因此，表明CYP5150AW6蛋白主要在細胞質和線粒體中完成蛋白質的加工與修飾。

3.2.5 CYP5150AW6蛋白二級結構及分析 蛋白質二級結構（secondary structure of protein）是指多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定的構象，即肽鏈主鏈骨架原子的空間位置排布，不涉及氨基酸殘基側鏈。蛋白質二級結構主要包括α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規(guī)卷曲四種形式。蛋白質二級結構預測對蛋白質三級結構的預測和構建起到重要的作用[26]。使用SPOMA在線軟件對CYP5150AW6蛋白的二級結構進行預測分析（圖6），結果顯示有49.06%的CYP5150AW6蛋白處于α螺旋狀態(tài)，有12.14%處于延伸狀態(tài)，有5.30%處于轉角狀態(tài)，有33.50%處于無規(guī)則卷曲狀態(tài)，表明目的蛋白大部分的氨基酸都處于卷曲狀態(tài)。

圖6 CYP5150AW6蛋白的二級結構預測

3.2.6 CYP5150AW6蛋白三級結構及分析 使用SWISS-MODEL在線軟件對CYP5150AW6蛋白三維結構進行預測分析，用Cytochrome P450 3A4（SMTL ID：4ny4.1.A）為模板，預測結果見圖7。

3.2.7 CYP5150AW6系統(tǒng)進化分析 從NCBI數據庫中挑選與暴馬桑黃CYP5150AW6氨基酸序列具有一定同源性的細胞色素P450家族的氨基酸序列，使用MEGA5.2.2軟件構建CYP5150AW6蛋白系統(tǒng)進化樹。結果如圖8所示，所有的CYP450家族基因編碼的蛋白聚為一大分支，說明其具有一個共同的起源。隨后又大致分為2個小分支，ERG24家族基因編碼的蛋白聚為一支，其它的聚為一支。在次一級的分支中，暴馬桑黃CYP5150AW6蛋白與靈芝CYP5150L8蛋白聚為一支，說明兩者親緣關系相對比較近，可能因為兩者都為多孔藥用真菌。以上結論符合物種分類原則。

圖7 CYP5150AW6蛋白的三級結構預測

圖8 CYP5150AW6系統(tǒng)進化分析

3.3 pET-32a-CYP5150AW6重組質粒的獲得

將線性化的pET-32a質粒和基因ORF重組后，得到pET-32a-重組質粒，以pET-32a-F、pET-32a-R（表1）為引物進行PCR擴增檢測。結果顯示在2000～4000 bp出現明顯條帶，與預測目的片段大小一致（圖9）。陽性質粒送至哈爾濱擎科生物公司測序后得到電子序列，序列分析結果表明重組質粒pET-32a-構建成功。

M-Marker 1～5-目的條帶

3.4 重組質粒pET-32a-CYP5150AW6原核表達分析

將測序結果正確的重組質粒pET-32a-轉入到大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21（DE3）后，利用終濃度為1 mmol/L IPTG誘導重組蛋白表達。SDS-PAGE檢測結果中顯示，在IPTG誘導2、4、6、8和10 h后，均在75 000～100 000表達出一條較一致的蛋白條帶，大小為86 080 bp（包含20 000 bp的標簽蛋白），表明蛋白的表達量隨誘導時間變化不大，且蛋白表達量都處于較高水平（圖10）。進一步證明重組質粒pET-32a-構建成功，并能通過IPTG誘導成功表達出目的蛋白。

3.5 CYP5150AW6基因在桑黃不同發(fā)育階段的表達水平

提取不同發(fā)育階段（菌絲體、原基、子實體）的暴馬桑黃材料的總RNA，反轉錄得到cDNA，以cDNA作為模板，采用qRT-PCR技術檢測基因的表達水平。結果見圖11，可以看出基因表達水平在不同的發(fā)育階段呈現依次上升趨勢，且在子實體階段達到最高，約為起始階段（菌絲階段第6天時）的12倍。

1-空白對照：質粒pET-32a未經誘導表達的菌體蛋白 2～7-質粒pET-32a-CYP5150AW6經1 mmol/L IPTG誘導0、2、4、6、8、10 h表達的菌體蛋白 M-Marker 箭頭指示為目的蛋白

圖11 CYP5150AW6基因在暴馬桑黃不同發(fā)育階段的轉錄水平

4 討論

CYPs在微生物和動植物體內廣泛存在，并參與到生物體的能量交換和物質代謝過程中，具有多種催化功能，被譽為萬能的催化劑[6]。近些年來，對于P450家族基因的研究越來越引起廣大研究者的關注。本實驗利用PCR技術克隆得到了基因的全cDNA序列，并進行生物信息學分析，結果表明基因具有完整的ORF；CYP5150AW6蛋白具有P450超家族的保守結構域，是P450家族基因；CYP5150AW6蛋白不具有跨膜區(qū)和信號肽，屬于親水的穩(wěn)定蛋白。亞細胞定位結果顯示該蛋白主要位于細胞質和線粒體中，表明其在細胞質和線粒體中修飾合成。系統(tǒng)進化分析顯示，暴馬桑黃CYP5150AW6蛋白與靈芝CYP5150L8蛋白聚為一支，說明兩者親緣關系較近。推測暴馬桑黃基因的功能可能與靈芝基因功能相似。

本實驗基于基因全長，以pET-32a作為表達載體，構建了重組質粒pET-32a-，轉入大腸桿菌BL21（DE3）中，并成功誘導表達出目的蛋白，說明該基因能夠表達出蛋白。同時進行了不同IPTG誘導時間蛋白表達量測定，結果顯示不同誘導時間蛋白表達量變化不大。說明在原核表達系統(tǒng)中，誘導時間長短與CYP5150AW6蛋白表達量沒有明顯的相關性，而在真核表達中兩者的相關性還有待于進一步檢測驗證。通過對基因在暴馬桑黃不同發(fā)育階段的表達水平檢測，發(fā)現該基因的轉錄水平從菌絲階段到子實體階段不斷增加，說明該基因可能與暴馬桑黃的生長發(fā)育過程有關。

目前隨著研究的深入，超過30萬種的CYPs基因在生物體內被發(fā)現。在真菌中，有約8.5萬種基因被發(fā)現，可分為32個Clan，805個Family，且功能多種多樣[13, 27]。有研究證明細胞色素P450基因除了能參與萜類和甾醇類化合物的合成，還具有參與催化生物體生長發(fā)育的作用。在植物中，母洪娜等[28]研究發(fā)現，“橙紅丹桂”中的基因在花器官中的表達量最高，且從鈴梗期開始逐漸升高。王蕾等[29]發(fā)現煙草CYP71D亞家族基因在根、葉、花中特異表達，部分能參與IAA激素、溫度等逆境脅迫反應。張杰等[30]克隆了馬鈴薯中的基因，此基因在根中表達量最高，能使油菜素甾醇（BR）失活，進而調節(jié)植株生長發(fā)育，此外，在擬南芥中也已證明和植株生長發(fā)育有關[31]。上述研究結果表明基因能參與生物體生長發(fā)育的調控，但當前在真菌中關于基因的研究報道相對較少，且多集中于萜類、甾醇的合成相關基因的研究。在暴馬桑黃中參與生長調控的基因尚未見報道。本試驗通過克隆，分子鑒定和差異表達分析初步判斷基因可能與暴馬桑黃的生長發(fā)育有關，但其具體調控途徑和作用機制有待進一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning and expression analysis ofgene of cytochrome P450 family in

LI Ya-wei1, LIU Zeng-cai1, SUN Ting-ting2, Wumuti Bahetibieke1, ZOU Li1

1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 2. Department of Food Engineering, Harbin University, Harbin 150086, China

To explore the function ofgene of cytochrome P450 family in the regulation of growth and development of.The full-length cDNA sequence of target gene was obtained by PCR, and the amino acid sequence was analyzed by bioinformatics online software. Prokaryotic expression vectors were constructed by homologous recombination. The qRT-PCR technology was used to analyze the expression characteristics in different developmental stages.The total length of the P450 gene (ORF) was 1758 bp, encoding 585 amino acids with a relative molecular weight of 66 080, and it was namedby P450 international naming committee. The prediction of the transmembrane region showed that CYP5150AW6 protein did not have a transmembrane structure. Subcellular localization showed that CYP5150AW6 was modified and synthesized in cytoplasm and mitochondria. Phylogenetic analysis showed that CYP5150AW6 protein was closely related to CYP5150L8 protein of, which was in accord with the principle of species classification. SDS-PAGE results confirmed the presence of target protein bands between 75 000—100 000 (containing 20 000 of the labeled protein), indicating that the obtained gene could successfully express the protein. According to the results of qRT-PCR analysis, the transcript level ofgene increased gradually from mycelium stage to fruiting body stage, and reached the highest level in fruiting body stage, indicating that this gene may be related to the growth and development of..Through the identification and analysis ofgene, it provides a theoretical basis for further study of the function ofgene in the regulation of growth and development of..

(Pilát) L. W. Zhou & Y. C. Dai; cytochrome P450 gene; growth and development; expression analysis;qRT-PCR

R286.12

A

0253 - 2670(2022)11 - 3448 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.022

2021-10-12

中央高校基本科研業(yè)務費資助項目（2572020DF06）

李亞偉，男，碩士研究生，現從事食用菌技術研究。E-mail: 2664508708@qq.com

鄒 莉，女，博士，教授，主要從事食用菌技術研究。E-mail: 13903650896@163.com

[責任編輯 時圣明]