張慧芳 孫文

摘 要：建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS）測定牛奶中9種磺胺類藥物的數(shù)學(xué)模型，并對測定過程的不確定度進(jìn)行了評估。當(dāng)牛奶中磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺異噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的含量分別為21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1時，擴(kuò)展不確定度分別為0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1（k=2）。結(jié)果表明，影響檢測結(jié)果的主要因素是標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其次是重復(fù)性。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;磺胺;牛奶;不確定度

Uncertainty Evaluation of 9 Sulfonamides Residues in Milk by HPLC-MS Method

ZHANG Huifang， SUN Wen*

（Institute of Food and Grain Inspection Technology， Shanxi Inspection and Testing Center，?Taiyuan 030012， China）

Abstract： A mathematical model for the determination of nine sulfonamides in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS） was established， and the uncertainty of the determination process was evaluated. When the contents of sulfadimidine， sulfadiazine， sulfapyridine， sulfamerazine， sulfisomidine， sulfameter， sulfamethoxazole， sulfisoxazole and sulfadimethoxine in milk were 21.272 μg·L-1， 22.336 μg·L-1，?19.352 μg·L-1， 21.312 μg·L-1， 20.840 μg·L-1， 22.680 μg·L-1， 20.456 μg·L-1， 21.816 μg·L-1 and 18.208 μg·L-1，?the expanded uncertainties were 0.323 2 μg·L-1， 0.255 8 μg·L-1， 0.093 8 μg·L-1， 0.127 4 μg·L-1， 0.127 4 μg·L-1，0.167 6 μg·L-1， 0.155 2 μg·L-1， 0.083 4 μg·L-1 and 0.321 8 μg·L-1（k=2）. The results showed that the main sources of?uncertainty arose from the standard curve fitting and repeatability.

Keywords： high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; sulfonamides; milk; uncertainty

磺胺類藥物（Sulfonamides）由于具有較廣的抗菌譜以及低廉的成本，在各類養(yǎng)殖行業(yè)被廣泛用于抑制細(xì)菌感染導(dǎo)致的各類疾病[1]。目前，檢測磺胺類藥物的常用方法是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]。文中測定方法參考《牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定》（農(nóng)業(yè)部781號公告—12—2006）[3]，對文件規(guī)定的9種磺胺類藥物進(jìn)行檢測。根據(jù)《化學(xué)分析測量不確定度評定》（JJF 1135—2005）[4]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]評定牛奶中9種磺胺類藥物殘留檢測結(jié)果的不確定度并分析不確定度的影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺異噁唑和磺胺二甲氧基嘧啶的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg·mL-1，純度均大于99.5%，北京曼哈格公司）和13C6-磺胺甲噁唑（純度均大于99.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）;甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純（德國默克公司）;牛奶選用磺胺類陰性備用樣品。

1.2 儀器與設(shè)備

5500 QTRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國SCIEX公司）;KDC-140HR臺式高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器公司）;BSA124S-CW電子天平（瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與加標(biāo)樣制備

乙腈溶解13C6-磺胺甲噁唑固體配制100 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備溶液，再用乙腈稀釋得100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。用超純水稀釋內(nèi)標(biāo)工作液得到12.5 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)稀釋液，用內(nèi)標(biāo)稀釋液稀釋4種磺胺類混合標(biāo)準(zhǔn)液得到含有磺胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1、50.0 ng·mL-1、100.0 ng·mL-1和200.0 ng·mL-1，內(nèi)標(biāo)濃度為12.5 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液加入磺胺陰性牛奶中充分溶解獲得加標(biāo)牛奶樣品，冷藏備用。

1.4 樣品前處理

參照《牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定》（農(nóng)業(yè)部781號公告—12—2006）中的處理方法。

1.5 儀器條件

液相色譜條件：C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）;流速0.8 mL·min-1;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量

2 μL;流動相0.02%甲酸水+0.02%甲酸乙腈，梯度洗脫。質(zhì)譜條件：電噴霧離子源正模式;掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測模式;脫溶劑氣溫度500 ℃;氣簾氣壓力50 psi;霧化氣壓力50 psi;內(nèi)標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

9種磺胺含量的計(jì)算公式為

式中：X為樣品中被測物質(zhì)含量，μg·L-1;，C為試液中被測物質(zhì)濃度，ng·mL-1;V為試液的定容體積，mL;f為樣品溶液稀釋倍數(shù);V為樣品體積，mL。

2.2 不確定度來源

根據(jù)測量過程和建立的數(shù)學(xué)模型，該檢測方法的不確定來源主要有：①配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度;②樣品量取引入的不確定度;③擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度;④重復(fù)性引入的不確定度。

2.3 不確定度的評定

2.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（s）

該過程引入的不確定度由稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及標(biāo)準(zhǔn)溶液移取體積的不確定分量組成。

稱量使用電子天平由檢定證書得到最大允差為0.000 3 g，假定符合均勻分布，包含因子，則有標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u（m）=0.000 173 2 g，稱取13C6-磺胺甲噁唑質(zhì)量為0.01 g，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（p）=u（m）/m=0.017 32。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程見1.3描述，構(gòu)成體積的不確定度分量由3個分量構(gòu)成。

（1）100 mL容量瓶體積V1有體積和溫度兩個分量。體積提供的分量為0.01 mL，溫度提供的分量為0.395 mL。故兩分量的合成不確定度u（V1）=0.399 mL，由定容體積V1引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（V1）=0.003 99。

（2）1 mL移液槍體積V2只包含體積分量。由1 mL移液槍體積V2引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（V2）=0.005 774。

（3）200 μL移液槍體積V3只包含體積分量。由200 μL移液槍體積V3引入的相對不確定為ur（V3）=0.002 309 4。100 mL容量瓶使用兩次，1 mL的移液槍和200 μL

移液槍各使用了8次，根據(jù)不確定度合成公式，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（s）為0.025 32。

2.3.2 樣品量取引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（V）

樣品用200 μL移液槍量取定容，其產(chǎn)生的不確定度有體積和重復(fù)性兩個分量。

（1）體積。根據(jù)JJG 646—2006規(guī)定，200 μL移液器容量允差為±0.4%，即±0.000 8 mL，近似于矩形分布，=0.000 461 88 mL，由移液槍體積V1引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為ur（V1）=0.002 309 4 mL。

（2）重復(fù)性。JJG 646—2006給出6次測定的RSD≤0.2%。得標(biāo)準(zhǔn)偏差S≤0.2×0.2%=0.000 4 mL。

兩分量合成不確定度為u（V）=0.002 34 mL。

因此，由樣品量取定容體積V引入的相對不確定度為ur（V）=0.011 7。

2.3.3 擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度ur（curve）

校準(zhǔn)工作曲線線性回歸方程為A=B1ρ+B0，回歸曲線由儀器軟件計(jì)算得到。

由此樣品溶液中磺胺類含量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為

式中：u（ρ）為樣品溶液中被測組分的標(biāo)準(zhǔn)不確定度;s為校準(zhǔn)工作曲線殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差;m為樣品溶液濃度x的測量次數(shù)，為2;n為校準(zhǔn)工作曲線的測量次數(shù)，

為6;ρ為樣品溶液中被測組分濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比的平均值（取2倍定量限濃度）：ρ（xz）為工作標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比的平均值，ρ（xz）=3.453;ρi為第i個校準(zhǔn)溶液的濃度與內(nèi)標(biāo)濃度比，i=9;校準(zhǔn)工作曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式為

由上述公式計(jì)算得到的9種磺胺類藥物校準(zhǔn)工作曲線引入的不確定度計(jì)算結(jié)果分別為0.229 7、0.172 1、

0.068 1、0.084 1、0.083 0、0.109 3、0.112 3、0.049 8和0.267 4。

2.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度ur（rep）

對陰性樣品以2倍定量限加標(biāo)（加標(biāo)樣的理論濃度為2.50 ng·mL-1）后，加標(biāo)樣品6次重復(fù)測定。按正態(tài)分布計(jì)算，重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。因此，重復(fù)性測定的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。由上述公式計(jì)算得到9種磺胺相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.023 4、0.019 1、0.009 5、0.022 7、0.026 7、0.007 9、0.009 3、0.013 1和0.030 5。

2.3.5 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度U

合成不確定度為，，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度為，由上述公式計(jì)算得到磺胺類藥物的不確定度評定結(jié)果如表1所示。

3 結(jié)論

通過對高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中9種磺胺類物質(zhì)含量的不確定來源進(jìn)行分析，對不確定度分量進(jìn)行量化和合成，當(dāng)牛奶中9種磺胺類物質(zhì)含量分別為21.272 μg·L-1、22.336 μg·L-1、19.352 μg·L-1、21.312 μg·L-1、20.840 μg·L-1、22.680 μg·L-1、20.456 μg·L-1、21.816 μg·L-1和18.208 μg·L-1時，擴(kuò)展不確定度分別為0.323 2 μg·L-1、0.255 8 μg·L-1、0.093 8 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.127 4 μg·L-1、0.167 6 μg·L-1、0.155 2 μg·L-1、0.083 4 μg·L-1和0.321 8 μg·L-1（k=2）。在實(shí)際操作過程中應(yīng)提高標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的測定頻率、增加重復(fù)次數(shù)、盡量使用混標(biāo)，減少單標(biāo)混合引起的誤差、選擇精度較高的吸量容器，從而確保標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性和穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有良好的重復(fù)性。

參考文獻(xiàn)

[1]張夢雪，趙義良，蘇青，等.水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留危害及常用檢測方法[J].今日畜牧獸醫(yī)，2019，35（7）：79-80.

[2]李朔，張璨，馬玲，等.QuEChERS結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同步測定魚肉制品中24種磺胺類抗生素[J].食品工業(yè)科技，2022，43（9）：301-308.

[3]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.牛奶中磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[EB/OL].（2006-12-16）[2022-06-05].http：//www.agri.cn/shichang/nybz_23263/200803/t20080321_1028668.htm.

[4]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.化學(xué)分析測量不確定度評定：JJF 1135—2005[S].北京：中國計(jì)量出版社，2005.

[5]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJF 1059.1—2012[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.