李源力，聶君蘭

（川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科 四川 南充 637002）

關(guān)節(jié)軟骨作為一種特殊性的分化結(jié)締組織，主要覆蓋于關(guān)節(jié)表面，可為關(guān)節(jié)活動提供摩擦平臺，并且可起到分散壓力，對于軟骨下具有支持和保護(hù)作用。對于軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix, ECM）來說，其是培養(yǎng)細(xì)胞附著的最佳“場所”，能夠有效地維持細(xì)胞處于正常的生長狀態(tài)，是維持細(xì)胞正常分化和關(guān)節(jié)運(yùn)動的優(yōu)質(zhì)外環(huán)境。人體軟骨細(xì)胞占據(jù)人軟骨組織細(xì)胞干重的5%，甚至更少比例，是關(guān)節(jié)軟骨組織中唯一細(xì)胞。在本研究中選取不同濃度的P-15 多肽培養(yǎng)液，對人體軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，旨在分析P-15 不同濃度對于體外軟骨細(xì)胞的生物特性的基本影響，以期為P-15 多肽培養(yǎng)基用于體外人軟骨細(xì)胞的有效培養(yǎng)提供數(shù)據(jù)資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年3 月—2021 年3 月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院接受股骨頸骨折開展全髖置換術(shù)的患者120 例，隨機(jī)分為對照組和觀察組各60 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①骨折部位明顯；②股骨頸骨折時間＜3 周；③年齡＜75 周歲；④知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有腫瘤患者；②病理性的骨折患者及髖關(guān)節(jié)患有類風(fēng)濕的患者。對照組年齡36 ～65 歲，平均年齡（48.34±0.23）歲；觀察組年齡37 ～66 歲，平均年齡（49.02±0.26）歲。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），具有可比性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 方法

（1）主要的實(shí)驗(yàn)儀器： 多用恒溫箱（Multi-Heater2800A）、低速離心機(jī)（TDL-5-A）、倒置顯微鏡（2×71（BX71））、熒光顯微鏡（BX51）、生物安全柜等；主要的實(shí)驗(yàn)試劑包含有：青霉素（華北制藥）、鏈霉素（魯抗制藥）、胰蛋白酶（美國）、Ⅱ型膠原酶（美國Sigma）等。甲苯按藍(lán)染液的配置：NaCl 1%的濃度，酒精選取70%濃度，甲苯胺藍(lán)原液的濃度為1%，甲苯胺藍(lán)工作液為1 mL 的甲苯胺藍(lán)原液+9 mL 1%的NaCl 溶液，實(shí)驗(yàn)時現(xiàn)配現(xiàn)用，保證試劑的新鮮度。（2）軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)：①軟骨細(xì)胞分離。收集股骨頸骨折行全髖關(guān)節(jié)置換的人股骨頭，轉(zhuǎn)至無菌操作臺進(jìn)一步處理；無菌刀片去凈關(guān)節(jié)表面滑膜及可能覆蓋其上的軟組織，再將軟骨組織盡可能薄層切下來（不能切到軟骨下組織），用盛有PBS 液培養(yǎng)皿收集軟骨組織片，用PBS 液漂洗3 次，盡可能去掉軟骨表面貼附的滑膜及血液；將漂洗后軟骨片移至裝有PBS 液的小玻璃瓶中，用眼科剪將軟骨片剪成1 ～3 mm大小碎片，將碎片移入50 mL 無菌離心管中，加入0.25%胰蛋白酶至剛好淹沒所有碎片，蓋上離心管蓋（使離心管蓋保持?jǐn)Q松狀態(tài)，保證CO可以進(jìn)出離心管），保持直立狀態(tài)放入37 ℃ CO孵箱中30 ～35 min。加入胎牛血清終止消化，并用PBS 液浸洗3 遍，倒掉離心管中液體；加入0.2%的Ⅱ型膠原酶至剛好淹沒軟骨碎片為宜，同樣擰松離心管蓋、直立狀態(tài)放入孵箱中，每小時震蕩離心管5 min 使軟骨組織和膠原酶充分接觸。肉眼觀察到液體變渾濁且有大片絮狀物出現(xiàn)時使用200 目金屬篩網(wǎng)過濾，剩余殘?jiān)鼮槲聪浌墙M織，回收到離心管中，加入Ⅱ型膠原酶繼續(xù)消化；消化時間據(jù)消化程度而定，但消化時間最好不超過12 h。②軟骨細(xì)胞的單層原代的培養(yǎng)。將檢測活力大于90%的原代軟骨細(xì)胞按照4×10個/mL 密度接種到25 cm的無菌塑料瓶中，培養(yǎng)基中含有20%的胎牛血清，DMEM 液，將培養(yǎng)瓶蓋擰松，放入孵化箱體中，箱內(nèi)的環(huán)境設(shè)計(jì)為：溫度37 ℃、二氧化碳的濃度為5%、濕度設(shè)計(jì)為95%。2 ～3 d 進(jìn)行換液處理。③軟骨細(xì)胞的傳代。將培養(yǎng)瓶底部的軟骨細(xì)胞的覆蓋率要達(dá)到85%以上，將原有的培養(yǎng)液廢棄，PBS 液對培養(yǎng)瓶進(jìn)行洗滌，消化時長最好設(shè)計(jì)為2 min 以內(nèi)，整個的消化過程中可選取使用培養(yǎng)瓶加上加速鐵壁軟骨細(xì)胞脫落，鏡下主要觀察細(xì)胞是否變圓。在培養(yǎng)液懸浮以后，加入含胎牛血清DMEM 溶液，終止消化處理，移入15 mL 無菌離心管中，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入含20%胎牛血清DMEM 液，吹打混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按1:2 接種于兩個新25 cm無菌塑料細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放回孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，等待軟骨細(xì)胞長滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶的底部85%及以上時，按照相同的方法進(jìn)行傳代培養(yǎng)。（3）軟骨細(xì)胞的鑒定：主要包含使用甲苯胺藍(lán)染色進(jìn)行鑒定處理。作為一種人工合成的醌亞胺類堿性染料，是由胺基、醌型苯環(huán)兩個發(fā)色團(tuán)構(gòu)成色原顯色；甲苯胺藍(lán)中存在陽離子，具備良好的染色作用；甲苯胺藍(lán)中還含有軟骨細(xì)胞糖胺多糖類酸性及陽性離子相結(jié)合的物質(zhì)，甲苯胺藍(lán)具有兩個助色團(tuán)，可促進(jìn)染料產(chǎn)生分離，進(jìn)而形成鹽類，幫助發(fā)色團(tuán)染色力。（4）收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液：主要包含有收集用于檢測細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)液上清液、收集用于檢測Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白含量的上清液。（5）軟骨細(xì)胞分泌Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白水平檢測：采用細(xì)胞增殖檢測試劑（Cell Counting Kit-8, CCK-8）檢測。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度對應(yīng)OD 值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)直線回歸方程，其中標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)孔位在1、2 孔位的濃度為30 pg/mL、3/4 孔位濃度為20 pg/mL、5/6 孔位濃度為10 pg/mL、7、8 濃度為5 pg/mL、9、10 濃度為2.5 pg/mL、11、12 濃度為0 pg/mL。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并比較兩組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)指標(biāo)，外形狀態(tài)、貼壁時間及在瓶底聚集覆蓋率（%）、Ⅱ型膠原免疫組化鑒定軟骨細(xì)胞顏色變化及細(xì)胞核形態(tài)、甲苯胺藍(lán)染色后陽性表達(dá)情況；CCK-8 測定P-15 多肽作用后軟骨細(xì)胞增殖變化，主要評估增殖時間（d）；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中P-15 濃度及FGF 濃度（pg/mL）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)

對于剛消化下來的軟骨細(xì)胞來說，其細(xì)胞的結(jié)構(gòu)主要呈現(xiàn)圓形，且呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)分布，部分細(xì)胞呈現(xiàn)出集落性生長，并且在培養(yǎng)12 h 時，會出現(xiàn)少量的細(xì)胞貼壁現(xiàn)象，大多數(shù)的細(xì)胞貼壁時間＞24 h，7 ～10 d 在培養(yǎng)瓶底部結(jié)構(gòu)的覆蓋率可達(dá)到85%以上。

2.2 Ⅱ型膠原免疫組化鑒定軟骨細(xì)胞

經(jīng)過染色后，軟骨細(xì)胞質(zhì)可見棕黃色顆粒，細(xì)胞核不著色。

2.3 甲苯胺藍(lán)染色

經(jīng)過甲苯胺藍(lán)染色處理后，陽離子與軟骨細(xì)胞分泌酸性糖胺多糖，并結(jié)合異染成紫紅色，呈現(xiàn)陽性表達(dá)。

2.4 CCK-8 測定不同濃度P-15 多肽作用后軟骨細(xì)胞增殖變化

CCK-8 測定不同濃度P-15 多肽作用后軟骨細(xì)胞增殖變化，兩組增殖變化比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），見表1。

表1 CCK-8 檢測軟骨細(xì)胞的增殖統(tǒng)計(jì)分析（OD 值）

2.5 細(xì)胞培養(yǎng)上清液中

FGF、BMP-2、PDGF-BB、IGFBP-34 因子水平FGF 隨培養(yǎng)時間增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中FGF 濃度越高，第8、10 d 上清液中FGF 差異不明顯，其他不同培養(yǎng)天數(shù)間上清液中FGF 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。選取第8 天培養(yǎng)上清液檢測，空白組FGF 濃度最低，與觀察組P-15 100 mg/L 及200 mg/L 濃度比較該因子濃度差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；空白組與觀察組P-15 50 mg/L 之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見表2。BMP-2 與上清液中FGF 檢測結(jié)果相似，第8、10 d 上清液中BMP-2 差異不顯著，其他不同培養(yǎng)天數(shù)間上清液中BMP-2 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）。取第8 天培養(yǎng)上清液檢測，空白組與觀察組P-15 不同濃度組比較，差異不顯著（＞0.05），見表3。

表2 第8 天培養(yǎng)上清液中FGF 濃度（±s）

表3 第8 天培養(yǎng)上清液中BMP-2 濃度（±s）

3.討論

通過上述分析得出主要結(jié)論：（1）軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)：從細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形狀看，大多呈現(xiàn)懸浮狀態(tài)，大都呈現(xiàn)集落性的生長，經(jīng)過12 h 的培養(yǎng)后，出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象，貼壁時間超過1 日，培養(yǎng)7 h 后的瓶底貼壁覆蓋率高于85%；（2）I 型膠原免疫組化鑒定軟骨細(xì)胞，細(xì)胞核不著色；（3）甲苯胺藍(lán)染色。經(jīng)過與軟骨細(xì)胞所分泌酸性糖胺多糖相比，可充分的結(jié)合染色，呈現(xiàn)陽性居多。

與同類實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比，本實(shí)驗(yàn)先進(jìn)處在于選取軟骨細(xì)胞表型變化，去分化發(fā)生“交界”的第三代人類軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)選取與人類近似的細(xì)胞，如兔關(guān)節(jié)軟骨單位體積的細(xì)胞，但是動物細(xì)胞比人類細(xì)胞的生長活躍。本實(shí)驗(yàn)選取患者關(guān)節(jié)置換術(shù)所獲取的軟骨組織消化所得的軟骨細(xì)胞，排除關(guān)節(jié)炎，更加符合人體實(shí)際生理狀態(tài)。

結(jié)合理論研究，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，體外軟骨細(xì)胞生長明顯快速于平臺期，但是由于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)前24 h 不適宜實(shí)驗(yàn)，因此未觀察到明確的潛伏期。相關(guān)研究也得出，體外培養(yǎng)細(xì)胞前3 d 高濃度的P-15 可以間接性的抑制細(xì)胞的增殖，本實(shí)驗(yàn)中，所觀察到的體外培養(yǎng)6 d后細(xì)胞呈現(xiàn)出生長停滯的狀態(tài)，同時需要考慮到多方面的原因。

綜上所述，P-15 多肽可高效的促進(jìn)經(jīng)體外培養(yǎng)的人軟骨組織的增生，當(dāng)其濃度在100 mg/L 時，對軟骨細(xì)胞擴(kuò)增作用最強(qiáng)；P-15 多肽濃度在100 mg/L 時效果最強(qiáng)。此外，自體軟骨細(xì)胞的移植術(shù)作為一項(xiàng)較為先進(jìn)的技術(shù)，仍然存在很多的難點(diǎn)問題，例如軟骨細(xì)胞的有效獲取、耗材費(fèi)用較高，體外培養(yǎng)細(xì)胞用血清對人體免疫排斥反應(yīng)等。因此在日后的相關(guān)研究中，手術(shù)技術(shù)、生物因子及材料等都需要進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化。