朱云，吳東娟，馬帥軍，張夢姣

腎細(xì)胞癌是起源于腎小管上皮組織的惡性腫瘤，占所有腎癌的 90%，20%～30%的腎細(xì)胞癌患者以轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌就診，20%～40%局部病變患者在手術(shù)后最終會發(fā)展為轉(zhuǎn)移性病變[1]。骨骼是除肺外腎細(xì)胞癌第二常見的轉(zhuǎn)移部位，發(fā)生率為24%～32%，骨轉(zhuǎn)移可引起嚴(yán)重骨骼破壞，嚴(yán)重降低患者生活質(zhì)量[2]。腫瘤細(xì)胞可通過將其免疫檢查點與T細(xì)胞上表達(dá)的受體結(jié)合來抑制T 細(xì)胞激活，導(dǎo)致免疫逃逸[3]。程序性死亡分子-1(programmed cell death protein 1，PD-1)通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性，促使抗原特異性T細(xì)胞凋亡，抑制免疫反應(yīng)和促進(jìn)自身耐受，程序性死亡分子-1配體(programmed cell death ligand 1，PD-L1)是免疫反應(yīng)的協(xié)同抑制因子，與PD-1結(jié)合減少PD-1陽性細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞因子分泌并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，PD-1/PD-L1軸與惡性腫瘤免疫逃逸、發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[4]?，F(xiàn)有研究顯示，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌外周血和腫瘤組織中PD-1、PD-L1表達(dá)均增高[5]，但其表達(dá)是否與腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移有關(guān)尚不清楚，鑒于此，現(xiàn)分析腎細(xì)胞癌患者外周血PD-1、PD-L1表達(dá)及其與腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年2月—2021年3月中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科收治腎細(xì)胞癌患者219例，其中發(fā)生骨轉(zhuǎn)移66例(骨轉(zhuǎn)移組)，未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移153例(無骨轉(zhuǎn)移組)。骨轉(zhuǎn)移組患者均經(jīng)放射性核素骨顯像或PET-CT證實骨轉(zhuǎn)移，并且骨轉(zhuǎn)移灶經(jīng)病理證實，符合“腎癌骨轉(zhuǎn)移臨床診療專家共識(2008版)”[6]。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(PZ021541)，患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實為腎細(xì)胞癌；②年齡18歲以上。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位惡性腫瘤；②臨床資料及病理資料缺失者；③合并自身免疫疾病者，接受PD-1抑制劑治療者。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床資料收集：收集性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、組織學(xué)類型、TNM分期、肌肉或骨痛癥狀、堿性磷酸酶升高(>125 U/L)、高鈣血癥(>2.75 mmol/L)等臨床資料。

1.3.2 外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)檢測：患者入組后24 h內(nèi)采集外周血3 ml注入EDTA抗凝試管混勻后加入RPMI-1640培養(yǎng)液(購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)100 μl混勻，加入CD4-FITC/PD-1-PE、CD8-FITC/PD-1-PE和CD14-FITC/PD-L1-PE單克隆抗體(購自武漢艾美捷科技有限公司)4℃反應(yīng)20 min。設(shè)陰性對照管，每個陰性對照管中分別加入CD4-FITC/IgG-PE、CD8-FITC/IgG-PE或CD14-FITC/IgG-PE，避光反應(yīng)20 min。每管內(nèi)加入紅細(xì)胞lysis Buffer(美國Beckman-Coulter公司)150 μl混勻，42℃水浴反應(yīng)10 min，磷酸鹽緩沖液洗滌，3000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)棄上清，加入磷酸鹽緩沖液500 μl重懸。EPICS-XL 流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)檢測CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料比較 骨轉(zhuǎn)移組患者年齡≥65歲、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有肌肉或骨痛癥狀、堿性磷酸酶升高、高鈣血癥比例高于無骨轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，2組性別、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、組織學(xué)類型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 骨轉(zhuǎn)移組和無骨轉(zhuǎn)移組臨床資料比較 [例(%)]

2.2 2組外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率比較 骨轉(zhuǎn)移組外周血CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率均高于無骨轉(zhuǎn)移組(P<0.01)，見表2、圖1。

注：A、B、C分別為無轉(zhuǎn)移組CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)比例；D、E、F分別為骨轉(zhuǎn)移組CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)比例

表2 骨轉(zhuǎn)移組和無骨轉(zhuǎn)移組外周血細(xì)胞表面PD-1/PD-L1表達(dá)率比較

2.3 腎細(xì)胞癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析 以年齡≥65歲、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、肌肉或骨痛癥狀、堿性磷酸酶升高、高鈣血癥、CD4+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率、CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率為自變量，骨轉(zhuǎn)移(賦值：0=否，1=是)為因變量，ENTER法篩選變量，最終結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、高鈣血癥、CD4+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率高、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率高、CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率高是腎細(xì)胞癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 腎細(xì)胞癌發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析

2.4 CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)診斷腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的價值 CD4+T 、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)診斷腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的曲線下面積分別為0.722、0.721、0.718，三者聯(lián)合診斷腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的曲線下面積為0.915，高于各自單獨診斷效能(Z=5.458、5.094、5.022，P均<0.001)，見表4、圖2。

圖2 CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)診斷腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的ROC圖

表4 CD4+T、CD8+T細(xì)胞表面PD-1及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)診斷腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的效能

3 討 論

骨是腎細(xì)胞癌血源性腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的主要部位，一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，治療難度將大幅增加，并可引起嚴(yán)重的骨痛、脊髓壓迫、病理性骨折和高鈣血癥，降低患者生存率[7]。免疫檢查點分子是共刺激受體，與配體結(jié)合后負(fù)向調(diào)節(jié)效應(yīng)免疫細(xì)胞，積極參與感染的免疫防御、自身免疫的預(yù)防、移植和腫瘤免疫逃避[8]。腫瘤免疫逃逸是造成腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵原因，免疫逃逸可促使上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞間黏附和基底膜黏附力，獲得侵入基底膜和血管及向遠(yuǎn)處遷移的能力[9-10]。PD-1是適應(yīng)性和先天免疫反應(yīng)的抑制劑，在腫瘤特異性T細(xì)胞上高度表達(dá)，PD-1與其配體PD-L1結(jié)合后產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制信號，下調(diào)T細(xì)胞活性，控制腫瘤微環(huán)境中免疫耐受的誘導(dǎo)和維持，導(dǎo)致抗腫瘤免疫反應(yīng)退化，促使腫瘤發(fā)生及腫瘤進(jìn)展[11-12]?，F(xiàn)有報道顯示，PD-1/PD-L1軸可通過磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路促使癌細(xì)胞增殖，還可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶信號通路調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。PD-1/PD-L1被證實與胃癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、三陰性乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、前列腺癌骨轉(zhuǎn)移有關(guān)[14-15]。但是PD-1、PD-L1與腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的報道十分少見。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率增高是腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移的危險因素，表明PD-1、PD-L1表達(dá)增高可能與腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為骨轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物。腎細(xì)胞癌多因溶骨性病變發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，溶骨性轉(zhuǎn)移是由于骨吸收細(xì)胞活性增強(qiáng)所致[16]。骨髓是巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T 細(xì)胞亞群等免疫細(xì)胞的儲存庫，直接調(diào)控免疫細(xì)胞增殖和分化，免疫細(xì)胞也可直接作用于骨細(xì)胞，調(diào)節(jié)骨細(xì)胞發(fā)育和骨代謝，腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞抑制可加劇骨—腫瘤微環(huán)境[17]。骨髓微環(huán)境同時為循環(huán)癌細(xì)胞歸巢、存活和增殖提供肥沃的土壤，當(dāng)癌細(xì)胞到達(dá)骨微環(huán)境時，誘導(dǎo)釋放各種因子，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白、轉(zhuǎn)化生長因子-β、胰島素樣生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子及其他刺激轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞生長的物質(zhì)，嵌入骨基質(zhì)中并導(dǎo)致成骨/破骨系統(tǒng)失衡[16]。因此，推測PD-1、PD-L1可能通過抑制T細(xì)胞、B 細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞活性抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，破壞骨—腫瘤微環(huán)境，促使腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，轉(zhuǎn)移至骨骼組織，發(fā)生溶骨性轉(zhuǎn)移。

本研究ROC分析結(jié)果顯示，PD-1、PD-L1診斷腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移均具有一定價值，聯(lián)合診斷骨轉(zhuǎn)移的效能明顯提高，可為臨床腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移判斷提供可靠的信息，對臨床進(jìn)一步治療具有指導(dǎo)價值。本研究回歸分析結(jié)果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、高鈣血癥與腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移也有關(guān)，提示臨床對TNM分期晚期、伴高鈣血癥患者應(yīng)警惕骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險。

綜上，腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率及CD14+單核細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)率均增高，且其增高與腎細(xì)胞癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生有關(guān)，可作為骨轉(zhuǎn)移診斷的潛在指標(biāo)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

朱云：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；吳東娟：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;馬帥軍：資料搜集整理，論文修改;張夢姣：課題設(shè)計，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析