孫 卿，王家鄉(xiāng)，李 鵬，謝 洋，周詩欽，吳 艷

（1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434025；2.西南大學動物科學技術(shù)學院，重慶 400715；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430064）

非洲鴕鳥（Struthio camelus）生活于非洲，食物以植物的莖、葉、果實等為主，其胃腸道［1，2］消化能力十分出眾，其腸道菌群具有特殊研究意義。乳酸菌作為常見的益生菌，研究其生物學特性，對鴕鳥源乳酸菌制劑的制備具有重要意義。本研究以健康成年非洲鴕鳥為試驗對象，采集其新鮮糞便進行乳酸菌的分離、鑒定，對分離得到的3株菌株進行生長曲線及菌液pH測定、酸和膽鹽耐受性試驗以及藥物敏感性試驗，在生物學特性研究基礎(chǔ)上進行篩選，以期獲得性能優(yōu)良的菌株，為乳酸菌進一步的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

從非洲鴕鳥新鮮糞便中分離鑒定出的3株乳酸菌M1、M2、M3。

1.2 試劑與儀器

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、吐溫-80、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、檸檬酸二銨、硫酸鎂、硫酸錳、瓊脂、豬膽鹽、pH試紙（上海三愛思試劑有限公司）；鏈霉素藥敏片（10μg/片）、卡那霉素藥敏片（30μg/片）、慶大霉素藥敏片（10μg/片）、四環(huán)素藥敏片（30μg/片）、氧氟沙星藥敏片（5μg/片）（杭州微生物試劑有限公司）。

二氧化碳培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（SK902，恒豐醫(yī)療器械有限公司）；冰箱（海爾集團）；電子天平（PGC2531，埃德姆衡器有限公司）；pH檢測儀（常州億通分析儀器制造有限公司）；石英比色皿、可見分光光度儀（上海光譜儀器有限公司）；滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司）；漩渦混合器（XW-80A，上海瀘西分析儀器廠有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長曲線及產(chǎn)酸曲線測定

1）生長曲線：將菌種在液體MRS中接種培養(yǎng)，每2 h取樣，利用分光光度儀于600 nm處測定吸光度（A600nm），繪制生長曲線。

2）產(chǎn)酸曲線：方法同上，每2 h取樣，通過pH檢測儀測定pH，繪制菌株產(chǎn)酸曲線。

1.3.2 抗逆性試驗

1）耐酸試驗：將菌株按5%接種量接入至pH 3的MRS液體培養(yǎng)基中，同時以pH 7的MRS液體培養(yǎng)基為對照組，培養(yǎng)3 h后用PBS溶液倍比稀釋，涂板計數(shù)，每組重復3次。

2）耐膽鹽試驗：將菌株按1%接種量接入到分別含有0、0.1%、0.3%和0.5%豬膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h，測定其A600nm，每組重復3次。

1.3.3 藥物敏感性試驗取50μL發(fā)酵菌液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，用干凈無菌的鑷子夾起藥敏紙片（氧氟沙星、鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素）放在培養(yǎng)基表面輕輕按壓，37℃厭氧培養(yǎng)24 h，依據(jù)藥敏片判定標準判定細菌的藥物敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線及產(chǎn)酸曲線

對菌株的生長繁殖以及產(chǎn)酸情況進行測定。如圖1所示，M1、M2、M3生長曲線基本一致，呈S形，0～6 h生長緩慢，為遲緩期，6～12 h內(nèi)生長最快，進入對數(shù)生長期，14 h后進入平緩期。如圖2所示，M1、M2、M3產(chǎn)酸能力也是基本一致，菌液pH不斷降低，其中M1最低點為4.95，M2最低點為4.93，M3最低點為4.92。在0～6 h之內(nèi)，菌液pH變化不明顯，表明生長遲緩。6～14 h之內(nèi)菌液pH下降較快，表明進入對數(shù)生長期，生長代謝加快。14 h后穩(wěn)定，生長代謝緩慢。

圖1 菌株生長曲線

圖2 菌株產(chǎn)酸曲線

2.2 耐酸試驗

如圖3所示，在pH 3的酸性環(huán)境中，培養(yǎng)3 h后用PBS溶液倍比稀釋，涂板計數(shù)發(fā)現(xiàn)M1菌株活菌濃度高于1×109CFU/mL，M2菌株活菌濃度約為1×107CFU/mL，M3菌株活菌濃度約為1×103CFU/mL，表明在pH 3的酸性環(huán)境中，M1的耐酸能力最強，M2的耐酸能力次之，M3的耐酸能力最差。

圖3 菌株耐酸能力

2.3 耐膽鹽試驗

如圖4所示，菌液培養(yǎng)12 h后測定其A600nm，表明在0.1%的豬膽鹽條件下，3株菌正常生長；在0.3%的豬膽鹽條件下，M1菌株生長受到抑制，而M2、M3生長情況依然良好；在0.5%的豬膽鹽條件下，3株菌生長均受到抑制。

圖4 菌株耐膽鹽能力

2.4 藥物敏感性試驗

如表1所示，經(jīng)37℃厭氧培養(yǎng)24 h后，M1、M2、M3菌株對鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素中度敏感，對四環(huán)素、氧氟沙星耐藥。

表1 藥物敏感性試驗結(jié)果

3 小結(jié)與討論

由于畜產(chǎn)品中藥物殘留和病原菌耐藥性增強等問題，例如不規(guī)范用藥造成的藥物殘留、耐藥菌增多等，嚴重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展并且損害人類健康。越來越多的國家開始重視無殘留和無污染的發(fā)酵產(chǎn)品，研究人員也正在尋找無毒無害的替代品，減少藥物危害。微生態(tài)制劑是一種可以替代抗生素的優(yōu)良產(chǎn)品。乳酸菌是一種重要的益生菌［3-5］，能發(fā)揮出良好的益生性，十分適合代替抗生素。動物源乳酸菌是天然理想的益生乳酸菌，其制劑可以降低機體膽固醇含量［6，7］、抗腫瘤、降血壓、改善糖尿病、抗氧化。其不僅可以提高免疫能力［8］，保護畜禽機體健康，產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，抑制腸道病原菌繁殖，還能夠減少藥物的使用。已有研究表明，為使乳酸菌制劑在動物機體內(nèi)產(chǎn)生效果，乳酸菌制劑需要保證其生長速度與動物進食后飼料在胃腸道內(nèi)的消化時間同步［9］，同時也要保證自身對膽鹽存在一定的耐受性［10］。除此以外，乳酸菌的藥物敏感性也有重要意義。益生菌與抗生素藥物配合使用能夠有效提高動物的生產(chǎn)能力［11］，但是抗生素在抑制有害菌生長的同時，也會殺死其他細菌［12］，從而減少益生菌的數(shù)量，影響機體的生態(tài)平衡。因為抗生素無法識別有害菌以及益生菌，所以只有提高益生菌的耐藥性，才能抵抗抗生素的侵襲，減少抗生素對機體的損害，并且減少細菌的耐藥性，從而產(chǎn)生理想的效果。

本試驗研究了3株非洲鴕鳥糞便中乳酸菌的生長規(guī)律以及產(chǎn)酸性能，發(fā)現(xiàn)3株乳酸菌接種6～12 h后進入對數(shù)生長期，14 h后進入平緩期。菌液pH 10～14 h時下降較快，表明此時進入對數(shù)生長期，生長代謝加快。18 h后穩(wěn)定，生長代謝緩慢。在抗逆方面，3株乳酸菌的耐酸和耐膽鹽能力，發(fā)現(xiàn)在pH3的酸性環(huán)境中，M1的菌株耐酸能力比M2、M3菌株強；在0.1%的豬膽鹽條件下，3株乳酸菌正常生長，在0.3%的豬膽鹽條件下，M2、M3菌株的耐膽鹽能力比M1菌株強，但是在0.5%的豬膽鹽條件下，3株菌生長均受到抑制。在藥物敏感方面，3株菌株對鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素中度敏感，對四環(huán)素、氧氟沙星耐藥。