羅 萍 張昊楠 徐建民 胡 冰 王曉萍 李光友 范春節(jié)*

（1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，國家林業(yè)和草原局熱帶林木培育重點實驗室中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州 510520；2. 南京林業(yè)大學，南京 210037；3. 林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業(yè)大學，哈爾濱 150040）

桉樹（spp.）是桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（）的總稱，原產(chǎn)澳大利亞及其附近島嶼。由于桉樹具有速生豐產(chǎn)、材質(zhì)優(yōu)良、適應性廣等優(yōu)良特性，因此廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界四大速生造林樹種之一，也是我國華南地區(qū)主要造林樹種之一。尾巨桉（×）是尾葉桉（.）與巨桉（.）的雜交種，具有明顯的雜種優(yōu)勢，其樹干通直均勻、輪伐周期短以及出材率高，是我國桉樹人工林的主栽品種。

近年來，植物基因工程技術(shù)在林木育種中被廣泛應用，彌補了常規(guī)育種周期長、定向改良難以控制、遠緣雜交或物種間雜交幾乎難以實現(xiàn)的不足。目前，不同桉樹品種已成功建立了農(nóng)桿菌（）介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，如赤桉（）、藍桉（）、尾葉桉等。部分研究獲得了與開花、材性、抗性等相關(guān)的轉(zhuǎn)基因株系并進行了田間試驗。盡管如此，以根癌農(nóng)桿菌（）介導法進行桉樹遺傳轉(zhuǎn)化存在著轉(zhuǎn)化效率低、穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化系統(tǒng)冗長耗時等問題，難以建立快速、高效的根癌農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，嚴重影響了桉樹的進一步遺傳改良和基因功能鑒定的進一步發(fā)展。而發(fā)根農(nóng)桿菌（）介導的遺傳轉(zhuǎn)化可以從外植體組織中快速、高效地誘導出大量的毛狀根。誘導的轉(zhuǎn)基因毛狀根可以用來開展體內(nèi)基因功能表征的研究，如亞細胞定位/雙分子熒光互補以及特定基因的功能鑒定。另外，這種轉(zhuǎn)基因體系也可以與常規(guī)基因工程方法，如過表達、基因沉默、基因編輯工具CRISPR/Cas9 等技術(shù)相結(jié)合。此外，通過載體優(yōu)化以及激素配比等方法在棉花（）、蒺藜苜蓿（）等植物中進行轉(zhuǎn)基因毛狀根的不定芽誘導，從獲得的轉(zhuǎn)基因組織中直接再生出完整的轉(zhuǎn)基因植株，這為發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的應用進一步拓寬了范圍。

關(guān)于發(fā)根農(nóng)桿菌介導的桉樹毛狀根轉(zhuǎn)化體系僅少量報道，且由于不同的桉樹種和無性系遺傳背景不一致，導致遺傳方法也有所差異，而對于我國華南地區(qū)廣泛種植的栽培品種尾巨桉的遺傳轉(zhuǎn)化體系國內(nèi)未見報道。因此，建立一個高效穩(wěn)定的發(fā)根農(nóng)桿菌介導的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系進一步開展桉樹木質(zhì)素合成、次生代謝產(chǎn)物合成等相關(guān)基因功能的鑒定顯得尤為重要。在本研究中，以華南地區(qū)廣泛種植的尾巨桉優(yōu)良無性系DH3229 為外植體材料，通過篩選外植體和農(nóng)桿菌菌株等重要因素開展毛狀根誘導，以期建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系，為今后開展桉樹特定基因功能的鑒定和桉樹的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以尾巨桉（×）優(yōu)良無性系DH3229的無菌苗為材料，在添加0.5 mg·L6-芐氨基嘌呤（6-BA）和0.1 mg·Lα-萘乙酸（NAA）的MS 基本培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)20～25 d，培養(yǎng)條件為光照時間16 h·d，光照強度100 μmol·m·s，培養(yǎng)溫度（25±2）℃。分別選取生長健壯，高度超過2 cm 的芽苗上的葉片和莖段為外植體材料，其中葉片選取完全舒展的葉片，莖段選取莖部節(jié)間，切除兩端腋芽。試驗所用材料由中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所保存培養(yǎng)。

卡那霉素（Kanamycin，KM）、鏈霉素（Strepto?mycin，Strep）、頭孢噻肟鈉（Cefotaxime sodium，Cef）和Wood Plant Medium（WPM）均購自Duchefa 公司，GUS 染色試劑盒購自北京華越洋生物技術(shù)有限公司，發(fā)根農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞均購自上海唯地生物技術(shù)有限公司，植物表達載體pBI121 為本實驗室保存，該載體含有35 S 啟動子，NOS 終止子，基因（卡那霉素抗性基因）和基因（編碼-葡萄糖醛酸苷酶基因）。發(fā)根農(nóng)桿菌的培養(yǎng)采用TY培養(yǎng)基（3 g·L酵母提取物+5 g·L蛋白胨+10 μmol·L氯化鈣，pH7.0），懸浮液（WPM+30 g·L蔗糖），共培養(yǎng)基（WPM+30 g·L蔗糖+6 g·L瓊脂），毛狀根誘導培養(yǎng)基（WPM+30 g·L蔗糖+2.5 mg·L聚乙烯吡咯烷酮PVP10+2 g·L交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮PVPP+0.8 g·L水解酪蛋白+200 mg·LCef+6 g·L瓊脂），懸浮液和培養(yǎng)基pH 值調(diào)整到5.8，然后高溫高壓滅菌備用。

1.2 方法

選取ArA4、Ar1193、K599、MSU440、ArQual 共5 種野生型發(fā)根農(nóng)桿菌菌株進行測試。取保存的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液，劃平板后挑取單菌落，分別接種至加有不同抗生素的TY 液體培養(yǎng)基中（見表1）。在28 ℃，200 r·min的恒溫搖床中培養(yǎng)過夜，4 000×離心10 min 收集菌液，棄上清，加入等體積的懸浮液，待侵染。

表1 發(fā)根農(nóng)桿菌類型及抗性Table 1 A.rhizogenes strain and antibiotics

取培養(yǎng)20～25 d 的增殖苗葉片和莖段為外植體，在外植體表面輕輕劃1～2 道傷口，置于含有農(nóng)桿菌的懸浮液中30 min，每隔5 min 震蕩一次。然后取出侵染后的外植體，使用無菌濾紙吸干表面菌液，放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培3 d，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃。隨后將外植體轉(zhuǎn)移到毛狀根誘導培養(yǎng)基中，在光照時間為16 h·d，光照強度100 μmol·m·s，以及培養(yǎng)溫度為（25±2）℃的條件下培養(yǎng)2～3 個星期，統(tǒng)計毛狀根誘導率，計算公式如下：

誘導率=產(chǎn)生毛狀根的外植體數(shù)量/總外植體數(shù)量×100%

采用電轉(zhuǎn)法將pBI121 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440 的感受態(tài)細胞中，加入600 μL 無抗生素的TY 培養(yǎng)基，28 ℃恒溫，200 r·min振蕩培養(yǎng)2～3 h，然后4 000×離心1 min 收集菌液，留取100 μL上清輕輕吹打混勻后涂布于附加有50 mg·L卡那霉素及50 mg·L鏈霉素的TY 固體培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d，挑取單克隆進行PCR 鑒定獲得陽性克隆，搖菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

將攜帶有質(zhì)粒pBI121 的發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440搖菌培養(yǎng)，待菌液濃度分別為OD=0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 時對葉片進行侵染，經(jīng)過共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)后，3 個星期后誘導出毛狀根，然后取出毛狀根進行GUS 染色分析。每個處理5 個重復，每個重復20～25 個外植體。將攜帶有質(zhì)粒pBI121 的發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440 搖菌培養(yǎng)，待菌液濃度分別為OD=0.3 時分別侵染葉片10、30、50、70、90 min，經(jīng)過共培養(yǎng)和篩選培養(yǎng)后，3個星期后誘導出毛狀根，然后取出毛狀根進行GUS 染色分析。每個處理5個重復，每個重復20～25個外植體。

在毛狀根誘導培養(yǎng)基中分別加入100、200、300、400、500 mg·L的Cef，3個星期后統(tǒng)計葉片毛狀根誘導率和毛狀根根長，確定抑菌劑對毛狀根誘導的影響。每個處理5 個重復，每個重復20～25個外植體。在毛狀根誘導培養(yǎng)基中分別加入0、10、15、20、25、30 mg·L的KM，3 個星期后統(tǒng)計葉片毛狀根誘導率和毛狀根根長，確定合適的篩選濃度。每個處理5 個重復，每個重復20～25 個外植體。

將獲得的所有毛狀根置于加有5-溴-4-氯-3-吲哚---葡萄糖苷酸（X-gluc）染液的離心管中，37 ℃避光保溫12～24 h，觀察顯色反應，統(tǒng)計染色率。以野生型菌株MSU440 侵染的毛狀根作為陰性對照，并計算陽性轉(zhuǎn)化率，計算公式如下：

陽性轉(zhuǎn)化率=染上藍色毛狀根數(shù)量/染色總數(shù)量×100%

選取抗性平板上的毛狀根，采用CTAB法提取毛狀根DNA，利用特異性引物基因和基因確定誘導出來的根是否為毛狀根，使用基因和基因引物進行PCR 檢測確定報告基因是否穩(wěn)定整合到毛狀根中（見表2）。

表2 引物列表Table 2 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 進行相關(guān)試驗的數(shù)據(jù)記錄以及柱狀圖的繪制，采用SPSS 分析軟件進行單方差分析（ANOVA）和Duncan 多重比較（=0.05），其中所有百分數(shù)要先經(jīng)平方根反正弦化處理再進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株和外植體對桉樹毛狀根誘導的影響

不同的發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對植物毛狀根的誘導能力存在差異。本研究中共選取5 種不同類型的發(fā)根農(nóng)桿菌包括ArA4、Ar1193、K599、MSU440、Ar?Qual（見表1），分別以葉片和莖段為外植體進行試驗。如圖1所示，不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對桉樹毛狀根的誘導呈現(xiàn)出明顯的差異，其中ArA4 和MSU440 菌株可以誘導出大量的毛狀根（見圖1：D，E），而K599 幾乎沒有毛狀根。與莖段相比，葉片為外植體材料時能夠獲得更高的毛狀根誘導。進一步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，以葉片為外植體時MSU440和ArA4 毛狀根誘導率較高分別為81.0% 和79.1%。與葉片略微不同，以莖段為外植體，ArA4誘導率最高，為59.2%，其次是MSU440，誘導率為25.4%（見圖2A）。通過對毛狀根根長的測定，發(fā)現(xiàn)Ar1193 誘導的毛狀根平均長度最長，為5.23 cm，其次是MSU440 和ArA4 分別為3.23、3.20 cm（見圖2B）。綜合毛狀根誘導率、毛狀根根長和形態(tài)的比較分析，在后期的試驗中，采用發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440 為侵染菌株，以葉片為受體材料，進行進一步轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化。

圖1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的毛狀根A～F 分別為對照、Ar1193、ArQual、ArA4、MSU440、K599，受體材料為葉片；G～L 分別為對照、Ar1193、ArQual、ArA4、MSU440、K599，受體材料為莖段Fig.1 Hairy roots induced by different A.rhizogenes A?F represent control，Ar1193，ArQual，ArA4，MSU440，K599，respectively，the leaves were used as receptor material；G?L represent control，Ar1193，ArQual，ArA4，MSU440，K599，respectively，the stem segments were used as receptor material

圖2 不同菌株和外植體對毛狀根的影響Fig.2 Effectsofdifferentstrainsandexplantsonhairyroots

2.2 毛狀根誘導和轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

農(nóng)桿菌的菌液濃度在一定的程度上能影響發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染效率。結(jié)果如圖3A～E 所示，菌液濃度顯著影響了毛狀根的誘導率和轉(zhuǎn)化率。菌液濃度在OD=0.1～0.9 范圍內(nèi)毛狀根誘導率及陽性轉(zhuǎn)化率都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢（見圖4A）。當OD為0.3 時，毛狀根誘導率達到峰值，為24.6%，顯著高于其他處理；其毛狀根陽性轉(zhuǎn)化率在OD為0.3 時也達到了峰值，其陽性率為20.5%，與其他處理組也存在著顯著性差異。與MSU440野生型農(nóng)桿菌相比，含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌其毛狀根誘導率大大下降，這可能與外源基因的插入以及誘導培養(yǎng)基中抗生素的加入有關(guān)。因此，綜合毛狀根誘導率以及陽性毛狀根誘導率比較分析，選取OD為0.3為最佳侵染濃度。

同時開展了不同侵染時間對毛狀根誘導率和轉(zhuǎn)化率的影響研究，結(jié)果如圖3F～J 所示。結(jié)果表明在一定的侵染時間范圍內(nèi)，毛狀根誘導率和陽性轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢（見圖4B）。當侵染時間為30 min 時毛狀根誘導率最高，為23.2%，且與其他處理相比存在著顯著的差異性。與毛狀根誘導率相似，對毛狀根陽性轉(zhuǎn)化率的統(tǒng)計結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)侵染30 min 時毛狀根陽性轉(zhuǎn)化率也達到了峰值，為20.2%，且與其他處理相比存在著顯著的差異性。因此，綜合毛狀根誘導率和陽性毛狀根誘導率比較分析，發(fā)現(xiàn)侵染30 min 可達到最佳的遺傳轉(zhuǎn)化效果，選定為最佳侵染時間。

圖3 菌液濃度和侵染時間對轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導率的影響A～E分別為農(nóng)桿菌菌液吸光值OD600為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9；F～J分別為侵染時間10、30、50、70、90 minFig.3 Effects of bacterial concentration and infection time on the induction rate of transgenic hairy roots A?E represent the Agrobacterium concentration，which OD600 reaches 0.1，0.3，0.5，0.7 and 0.9 respectively；F?J represent the infection time of 10，30，50，70 and 90 min，respectively

圖4 菌液濃度和侵染時間對轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導率的影響Fig.4 Effects of bacterial concentration and infection time on the induction rate of transgenic hairy roots

2.3 抗生素對毛狀根誘導的影響

為了抑制農(nóng)桿菌的生長需加入適量的抑菌生長素，同時抑菌劑的添加可能會對毛狀根的誘導和生長產(chǎn)生影響，為了確定抑菌抗生素是否對毛狀根的生長造成影響。本研究中，在誘導培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的Cef 進行確定合適的抑菌劑濃度。結(jié)果表明：在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度的Cef 對尾巨桉葉片毛狀根誘導率和毛狀根根長的影響差異不顯著（見圖5）。在添加量為200 mg·L時，培養(yǎng)基中的農(nóng)桿菌在一定時間范圍內(nèi)基本受到抑制。綜合毛狀根誘導率及表型和經(jīng)濟效益考慮，確定最適的Cef 抑菌濃度為200 mg·L。

圖5 Cef質(zhì)量濃度對毛狀根誘導率（A）和毛狀根根長（B）的影響Fig.5 Effect of cefotaxime sodium concentration on inducing rate（A）and length of hairy roots（B）

在此基礎上，將桉樹葉片分別接種于含有不同卡那霉素濃度的毛狀根誘導培養(yǎng)基中，以確定合適的KM 篩選壓。結(jié)果表明，KM 濃度顯著影響了毛狀根的誘導率和毛狀根根長（見圖6）。與對照相比，隨著卡那霉素濃度增加，毛狀根生長明顯受到抑制，且毛狀根長度明顯變短，當濃度為20 mg·L時，毛狀根生長完全被抑制。因此，20 mg·L卡那霉素濃度為篩選轉(zhuǎn)基因毛狀根的最適濃度。

圖6 卡那霉素對毛狀根誘導率（A）和毛狀根根長（B）的影響Fig.6 Effect of kanamycin concentration on inducing rate（A）and length of hairy roots（B）

2.4 轉(zhuǎn)基因毛狀根的獲得與鑒定

在建立起的毛狀根誘導和轉(zhuǎn)化體系的基礎上，通過抗生素篩選后獲得大量的毛狀根，為進一步驗證GUS等外源基因是否整合到發(fā)根農(nóng)桿菌誘導形成的桉樹毛狀根基因組中，選取卡那霉素抗性平板上生長的毛狀根，進行GUS 組織化學染色（見圖7A）。另外提取抗性板上的毛狀根基因組DNA，并利用特異性引物PCR（見表2）分別檢測、、和基因。由圖7B、C 可知，和基因已經(jīng)整合到桉樹毛狀根中。進一步采用和基因檢測表明外源的基因已穩(wěn)定整合到毛狀根的基因組中。經(jīng)卡那霉素篩選后獲得了23.2%的毛狀根誘導率，其中87.1%發(fā)生了顯色反應，轉(zhuǎn)化率為20.2%。

圖7 桉樹毛狀根的誘導過程簡易圖以及轉(zhuǎn)基因毛狀根的GUS組織化學染色分析（A）和PCR分子鑒定（B～C）A.1～2 為陰性對照；3～5 為陽性毛狀根；圖B～C 中1，5 為陽性對照，2，6 為陰性對照（野生型菌株侵染得到的毛狀根），3，7 為ddH2O（陰性對照），4，8為抗性板上誘導的毛狀根；B.分別檢測rola，rolb；C.分別檢測NPTⅡ，GUS Fig.7 Chart of Eucalyptus hairy root and GUS histochemical staining analysis（A）and molecular analysis of hairy roots（B～C）A.1?2 are negative controls；3?5 are positive hairy roots；In figures B and C，1，5 are positive controls，2，6 are negative control（shairy roots infected by wild-type strains），3，7 are ddH2O（negative control），4，8 are hairy roots induced on the resistant plate；B detects rola and rolb genes respective?ly；C detects NPTⅡand GUS genes respectively

3 討論

由于發(fā)根農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系具有便利性和高效性，目前在多種植物中開展應用，尤其是在缺乏高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的非模式物種以及生長周期較長，轉(zhuǎn)化困難的木本植物中，已有不少報道。例如Meng 等在木豆（）中利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的轉(zhuǎn)基因毛狀根作為試驗材料，采用雙分子熒光互補分析驗證CBLs 與CIPKs相互作用。Plasencia 等在巨桉中利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4RS 誘導巨桉生成毛狀根對木質(zhì)素生物合成的基因CCR1進行功能分析。由此可見，利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為基因功能的鑒定提供了一條新途徑。

發(fā)根農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立受許多因素的影響，包括菌株類型、外植體類型、菌液濃度和侵染時間等。發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植物的受傷部位后，會將其Ri質(zhì)粒的T-DNA 區(qū)的DNA 片段插入并整合至宿主細胞的基因組，因此，不同Ri質(zhì)粒類型的發(fā)根農(nóng)桿菌具有不同的致根能力。本研究中無論以桉樹葉片還是莖段為外植體時，黃瓜堿型K599 菌株無法誘導其毛狀根形成，這與Meng等發(fā)現(xiàn)K599廣泛適用于多種植物的結(jié)果有所不同，可能是由于不同物種之間的差異。而另外4種農(nóng)桿堿型菌株均有一定的誘導毛狀根的能力，其中MSU440 誘導毛狀根的能力高于其他3 種農(nóng)桿堿型菌株，且毛狀根生長粗壯、狀態(tài)較好，是開展尾巨桉發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的首選菌株。肖璇在建立甜橙（）的遺傳轉(zhuǎn)化體系中表明MSU440誘導的毛狀根效果最好，其毛狀根轉(zhuǎn)化效率高達68.3%。Gharari 等使用MSU440 對黃芩（）的莖段外植體進行注射時發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化頻率可達100%，與本研究采用的菌株一致。

外植體類型是毛狀根遺傳轉(zhuǎn)化過程中的一大重要因素。本研究選用葉片和莖段作為外植體材料，盡管不同農(nóng)桿菌菌株在毛狀根誘導率上存在一定的差異，但是不管使用哪種菌株都是葉片較莖段更為敏感，誘導率較高。與之相似，劉雪羽等在建立發(fā)根農(nóng)桿菌介導光皮樺（）的遺傳轉(zhuǎn)化體系中表明，葉片作為外植體能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化效率，其轉(zhuǎn)化率為36.4%，高于莖段和種子苗下胚軸。賴家業(yè)等在建立的根癌農(nóng)桿菌介導的尾巨桉遺傳轉(zhuǎn)化體系中發(fā)現(xiàn)，莖段誘導的愈傷組織質(zhì)量較高，可再分化出不定芽，并保持較高的分化率。主要原因可能是由于不同品種之間的差異，也有可能是根癌農(nóng)桿菌與發(fā)根農(nóng)桿菌對外植體的敏感程度不同造成的。

另外菌液濃度和侵染時間也是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素。本研究結(jié)果表明在菌液OD為0.3、侵染時間為30 min，以及葉片為外植體時毛狀根的誘導率及轉(zhuǎn)化率最高，這與劉思巧在研究發(fā)根農(nóng)桿菌介導銀杏（）毛狀根培養(yǎng)中得出的結(jié)論相似。丁雪在建立銀中楊（×）的遺傳轉(zhuǎn)化體系中也表明最佳侵染時間為30 min，其轉(zhuǎn)化效率達到了57.0%。主要原因可能是菌液濃度過低或侵染時間過短時農(nóng)桿菌可能無法大量吸附于外植體細胞壁，從而導致外源基因無法整合到植物中。而當農(nóng)桿菌菌液濃度過高或侵染時間較長時，大量農(nóng)桿菌附著于外植體表面，共培養(yǎng)過程中農(nóng)桿菌大量繁殖導致后期脫菌困難，引起植物褐化死亡，導致毛狀根誘導率及轉(zhuǎn)化率均降低。

獲得KM 的最適篩選壓是植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中十分關(guān)鍵的步驟，是獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根的重要因素。本試驗中以無性系尾巨桉DH3229 的葉片作為外植體，在KM 濃度為20 mg·L時，毛狀根生長完全被抑制。這與周利建等在建立根癌農(nóng)桿菌介導的巨尾桉遺傳轉(zhuǎn)化體系過程中的研究結(jié)果相同。根據(jù)其他研究者的試驗結(jié)果可知不同品系的桉樹篩選壓大小會有較大差別。Mullin 等在研究赤桉的報告中表明，9 mg·L的KM 能抑制未轉(zhuǎn)化外植體再生出植株，10 mg·L的KM能抑制根的生長。而藍桉具有較高的KM抗性，愈傷組織在KM濃度75～100 mg·L時仍然有植株再生。

4 結(jié)論

本研究以尾巨桉優(yōu)良無性系DH3229 為外植體材料，分別優(yōu)化了發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、外植體材料以及菌液濃度等因素，并通過GUS 染色分析和PCR 分子檢測證實該體系可以穩(wěn)定獲得轉(zhuǎn)基因毛狀根，其轉(zhuǎn)化效率為20.2%。但是誘導率和轉(zhuǎn)化率都有待進一步提高，可以從其他因素來進一步完善遺傳轉(zhuǎn)化體系，例如酚類物質(zhì)乙酰丁香酮的添加以及基本培養(yǎng)基的選擇等。本研究建立的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系為今后尾巨桉優(yōu)良無性系DH3229優(yōu)良基因的挖掘奠定基礎。同時，也為后續(xù)利用毛狀根誘導完整的轉(zhuǎn)基因再生植株提供穩(wěn)定的材料。