陳思思 謝牧洪 崔茂凱 李文凱 徐正剛 賈彩霞 楊桂燕

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西省經(jīng)濟植物資源開發(fā)利用重點實驗室，楊凌 712100）

近些年，由采礦、廢氣排放、污水灌溉、重金屬超標制品濫用等人為因素致使含有重金屬的污水或者廢料排放到土壤里，導(dǎo)致土壤受到嚴重的重金屬污染。重金屬在土壤中能引起土壤成分、結(jié)構(gòu)和功能的改變，重金屬離子通過抑制作物根系生長和光合作用，使作物減產(chǎn)，糧食的生產(chǎn)面積縮小。更為嚴重的是，重金屬可以通過食物鏈轉(zhuǎn)移到動物和人體內(nèi)，嚴重危害動物和人的健康。隨著我國工業(yè)化進程加快，我國土壤重金屬污染問題日益加劇，在眾多重金屬污染中，鎘（Cd）被確認為我國土壤的首要污染物。鎘在自然環(huán)境中具有化學(xué)活性強、移動性大、毒性持久、易富集等特點，因此受鎘污染土壤的治理難度很大。植物修復(fù)利用自然生長或遺傳工程培育的植物來修復(fù)重金屬污染土壤，是目前治理土壤污染的重要方法，具有較高的環(huán)保和經(jīng)濟價值。

構(gòu)樹（）是重要的扶貧攻堅樹種，具有生長迅速、環(huán)境適應(yīng)性強、分布廣泛、易于繁殖等優(yōu)良特性，也是尾礦區(qū)和重金屬污染地區(qū)的先鋒樹種和本土樹種，對多種重金屬元素具有良好的吸收和耐受力。但構(gòu)樹優(yōu)良品系的開發(fā)不夠，構(gòu)樹適應(yīng)重金屬的機理尚不清楚，這對發(fā)展構(gòu)樹生物修復(fù)不利。要充分發(fā)揮構(gòu)樹在重金屬土壤修復(fù)中的功能，其前提是掌握構(gòu)樹重金屬適應(yīng)機制，通過常規(guī)或分子育種培育Cd高抗高耐受型構(gòu)樹新品種。因此，本研究旨在鑒定構(gòu)樹重要的Cd響應(yīng)基因，為開展構(gòu)樹抗Cd分子育種提供候選基因。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）是真核生物中重要的調(diào)控蛋白。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子是許多信號網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，如植物生長、生物或非生物脅迫等。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）是轉(zhuǎn)錄因子中重要的蛋白質(zhì)家族之一。植物中的bZIP 一般由60～80 個氨基酸殘基組成，含有1 個堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，氨基酸殘基組成的堿性結(jié)構(gòu)域與特異DNA 序列相結(jié)合，起核定位信號作用，亮氨酸拉鏈形成兩親性的α 螺旋結(jié)構(gòu)，參與bZIP 蛋白與DNA 結(jié)合之前的二聚體化。在前期對構(gòu)樹響應(yīng)Cd 脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，我們獲得了受Cd 脅迫上調(diào)表達的眾多基因，其中包括堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zip?per，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族中的若干成員。

現(xiàn)代分子生物研究顯示，bZIP 是植物生長過程的重要調(diào)節(jié)劑，如組織分化、細胞伸長、病原體防御、激素信號傳導(dǎo)、光反應(yīng)以及滲透控制。針對bZIP 調(diào)控植物抗逆的研究顯示，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可參與抗病、抗寒、抗旱、耐鹽和抗重金屬離子等多種逆境脅迫調(diào)控。如，水稻（）中過表達顯著提高了植株對干旱、鹽和PEG 滲透脅迫的耐受性，鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因和參與水稻Zn和CdCl的吸收和轉(zhuǎn)運；大豆（）參與大豆耐藥性、耐鹽性、干旱耐受性的調(diào)控；苧麻（）在響應(yīng)高鹽脅迫時起正向調(diào)控作用，在植物響應(yīng)干旱和重金屬Cd 脅迫時起負向調(diào)控作用。因此，本研究對響應(yīng)Cd脅迫表達較為突出的1個bZIP成員（命名為）進行Cd脅迫下的表達和轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd分析，以期為揭示構(gòu)樹Cd適應(yīng)分子機制和抗逆分子育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

植物材料：同批次構(gòu)樹組培苗轉(zhuǎn)移至土壤生長至2年。

處理方法：使用分析純的CdCl配置150 μmol·L的CdCl溶液，對構(gòu)樹進行脅迫處理，在處理后0、3、12、24、48、72 h 等時間點分別取根、莖、葉，將根、莖、葉用液氮速凍后，于冰箱中-80℃保存?zhèn)溆?，每個處理包含5棵植株。

1.2 BpbZIP1基因的克隆與分析

在以構(gòu)樹Cd 脅迫下的轉(zhuǎn)錄組篩選出的上調(diào)表達基因中，篩選bZIP 家族成員，選擇其中1 條表達值較高的基因（命名為）進行分析?；虻拈_放讀碼框（ORF）用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）確定。根據(jù)基因ORF 兩端序列設(shè)計引物-和-（見表1），進行PCR 擴增。產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)進行菌液PCR驗證，對可獲得目的片段的克隆測序。

表1 本研究涉及引物Table 1 The primers used in the study

利用Expasy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對確認的基因序列特征進行分析。利用BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進行序列同源性搜索。利用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用ClustalX 進行蛋白質(zhì)多序列比對。使用CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc?ture/cdd/wrpsb. cgi）和MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行BpbZIP1 的保守結(jié)構(gòu)域分析。利用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）推 測BpbZIP1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，利用Swiss Model（https：//swissmod?el.expasy.org/）推測BpbZIP1 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/Cell-PLoc-2/）進行蛋白質(zhì)亞細胞定位預(yù)測。

1.3 BpbZIP1基因的表達分析

對1.1 中收集樣品進行基因表達量分析。RNA 提取采用CTAB 法進行，RNA 經(jīng)DNA 消化酶處理后采用PrimeScriptRT reagent Kit（CWBIO，康為世紀，中國）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后用作qRT-PCR 的模板。qRT-PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）進行，內(nèi)參基因為。所用引物如表1所示，定量引物為DL-F和DL-R。定量反應(yīng)所用儀器為Applied Biosystems生產(chǎn)的StepOneReal Time PCR System。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性12 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，45個循環(huán)；81 ℃讀板1 s，每個樣品重復(fù)3次。采用2法對定量結(jié)果進行相對分析，表示為相對于內(nèi)參基因相對于對照的表達值。數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件包（SPSS，Chicago，Illinois，USA）分析。樣品變異性用標準偏差表示。不同時間點與0 h之間的表達差異用檢驗分析（<0.05）。

1.4 酵母表達載體構(gòu)建及脅迫分析

根據(jù)基因序列特征及pYES2 酶切位點特性設(shè)計酵母表達載體引物BpbZIP1-JM-F 和BpbZIP1-JM-R（見表1）。通過PCR 反應(yīng)獲得含有酶切位點的序列，經(jīng)酶切純化后與pYES2連接獲得重組載體pYES2-BpbZIP1。將pYES2-BpbZIP1 和空pYES2 載體分別轉(zhuǎn)入酵母INVSC1中，分別記為INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2），后者為對照。本研究所用工具酶均為寶生物（Takara）公司產(chǎn)品。

分 別 挑 取INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和IN?VSC1（pYES2）單克隆置于含2%葡萄糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)16 h，收集酵母菌體重懸于含2%半乳糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，且調(diào)整OD=0.5，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD=1.8，分別收集菌體進行Cd 脅迫處理。即，取相同量的上述INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）菌體，分別在含有0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% CdCl的SC-Ura 液體培養(yǎng)基（含2%葡萄糖）中震蕩培養(yǎng)30 h，測定酵母生長活性（OD）。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件包分析。樣品變異性用標準偏差表示。相同處理下INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）之間的差異顯著性用檢驗分析（<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpbZIP1基因基本生物信息

通過對構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組篩查鑒定獲得基因（GeneBank 登錄號：MW567468），根據(jù)獲得的cDNA 序列設(shè)計引物BpbZIP1-F/R 進行PCR 驗證，確定該基因序列ORF長1 713 bp，編碼的蛋白包含570 個氨基酸，分子量為62 902.38 Da，等電點為4.62。保守域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白有bZIP 結(jié)構(gòu)域（見圖1）。Swiss Model 同源建模預(yù)測的BpbZIP1 蛋白三維結(jié)構(gòu)是典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（見圖2：A～B），BpbZIP1 二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件為無規(guī)則卷曲和螺旋，占總氨基酸的48.95% 和39.12%，其余延伸鏈和轉(zhuǎn)角分別占8.25%、3.68%（見圖2C）。經(jīng)同源搜索并進行進化分析，顯示BpbZIP1蛋白與擬南芥（）ZIP同源，且與AtbZIP1 的進化關(guān)系較近（見圖3）。將BpbZIP1蛋白與擬南芥同源蛋白進行多序列對比，顯示出高度的相似性（見圖4A），同時BpbZIP1 蛋白與擬南芥同源蛋白都具有相同的保守結(jié)構(gòu)域（見圖4B）。對BpbZIP1 蛋白進行亞細胞定位預(yù)測，顯示BpbZIP1蛋白為核蛋白。

圖1 BpbZIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 The conserved domain of BpbZIP1 protein

圖2 BpbZIP1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測A.與非冗余PDB（Protein Data Bank）結(jié)構(gòu)集比較；B.三維結(jié)構(gòu)模型；C.二級結(jié)構(gòu)；h.α螺旋；e.延伸鏈；t.β轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲Fig.2 Predicted structure of BpbZIP1 protein A.Comparison with non-redundant set of PDB（Protein Data Bank）structures；B.3D structure model；C.Secondary structure；h. α helix；e.Extended strand；t.Beta turn；c.Random coil

圖3 BpbZIP1與擬南芥相似蛋白的進化樹括號內(nèi)為登錄號；Bb.構(gòu)樹；At.擬南芥Fig.3 Phylogenetic tree of BpbZIP1 protein GeneBank accession number in brackets；Bb.B.papyrifera；At.A.thaliana

2.2 BpbZIP1基因在Cd脅迫下的表達

提取CdCl脅迫不同時間點的根、莖、葉的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 用作qRT-PCR 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因能被Cd 脅迫誘導(dǎo)表達，且在根、莖、葉中具有一定差異（見圖4）。在根中，基因受脅迫后迅速被誘導(dǎo)，在3 h 達到最高水平，為對照組的17.4 倍；之后表達水平逐漸下降，但72 h 仍處于上調(diào)表達。在莖中，基因隨時間延長的表達變化趨勢同根中表現(xiàn)相似，均為倒‘V’字形，但整體上根中的表達要高于莖中的表達，且莖中出現(xiàn)的峰值在12 h，為對照的5.6 倍。在葉中，基因的轉(zhuǎn)錄水平隨脅迫時間延長不斷升高，在72 h為對照的5.1倍（見圖5）。

圖4 BpbZIP1與擬南芥同源蛋白多序列對比（A）及其motif（B）Fig.4 Multiple sequence alignment of BpbZIP1 and A.thaliana homologous proteins（A）and its motif logos（B）

圖5 BpbZIP1基因在Cd處理下的表達水平**，*分別表示同一組織在不同時間點與0 h 之間的差異極顯著（P<0.001）和顯著（P<0.05）Fig.5 The expression level of BpbZIP1 gene under different time of CdCl2 treatment**，* mean that the difference between the same tissue at different time points and 0 h was extremely significan（tP<0.001）and signifi?can（tP<0.05）

2.3 BpbZIP1基因表達對酵母抗Cd性的影響

分 別 挑 取INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和IN?VSC1（pYES2）單克隆在相同條件下培養(yǎng)并進行不同CdCl濃度處理，比較二者在Cd 脅迫下的生長活性。結(jié)果顯示，在非脅迫條件下，INVSC1（pY?ES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）的生長沒有明顯區(qū)別，但在CdCl脅迫處理后，INVSC1（pYES2-Bp?bZIP1）和INVSC1（pYES2）的OD明顯下降，且隨著CdCl濃度增加，INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）的OD逐漸變小，但INVSC1（pY?ES2-BpbZIP1）一直高于INVSC1（pYES2），且差異顯著（見圖6）。表明基因的表達顯著改善了酵母的CdCl脅迫性能。

圖6 轉(zhuǎn)BpbZIP1基因酵母在鎘脅迫下的OD600**表示相同處理條件下INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）之間的差異性顯著性（P<0.01）Fig.6 The OD600 of BpbZIP1 transgenic yeasts under different CdCl2 concentrations** indicates the significant difference between INVSC1（pYES2-BpbZIP1）and INVSC1（pYES2）under the same treatment conditions（P<0.01）

3 討論

植物修復(fù)（Phytoremediation）是一種利用自然生長植物或者遺傳工程培育植物修復(fù)金屬污染土壤環(huán)境的技術(shù)，是一種經(jīng)濟、高效的方法。超級積累植物可以從土壤中吸取金屬污染物以達到降低或去除土壤重金屬污染的目的。目前發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物已經(jīng)多達700 多種，如，我國東南景天（）為Cd 和Zn 超級積累植物；土荊芥（）為Pb 超級積累植物；商陸（）能大量富集Cd；蕁麻（）對Zn有較強富集能力?？梢?，植物在重金屬治理過程中可以發(fā)揮重要作用，發(fā)展植物修復(fù)方法可行性強。構(gòu)樹以其突出的經(jīng)濟價值和優(yōu)良的生態(tài)適應(yīng)性受到廣泛關(guān)注。商侃侃等分析了54 種木本植物對土壤Cu、Pb、Zn 的提取能力，結(jié)果表明構(gòu)樹具有較強的金屬離子綜合提取能力。金裕華等研究表明構(gòu)樹在重金屬污染土壤中適應(yīng)性較強、生長良好。曾鵬等研究顯示蘆竹（）與構(gòu)樹、桑樹（）間種可有效用于重金屬污染土壤修復(fù)?？梢?，充分掌握構(gòu)樹的重金屬響應(yīng)分子機制，能為更好地應(yīng)用構(gòu)樹于重金屬污染修復(fù)提供依據(jù)。

本研究鑒定獲得的基因與擬南芥bZIP的較多成員具有較近的親緣關(guān)系（見圖3），其中與的進化關(guān)系較近；是一個糖調(diào)控基因，介導(dǎo)糖信號，影響基因的表達和植物的生長發(fā)育。且Sun 等研究證明參與植物生物調(diào)控，發(fā)現(xiàn)其為植物耐鹽、耐滲透和耐鹽性的正向調(diào)節(jié)因子。參與植物中活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而ROS 作為信號分子調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)。是葡萄糖-ABA 相互作用網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點，根據(jù)糖的供應(yīng)情況參與ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)。所以，我們初步認為基因可能與植物非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。

為進一步明確基因是否能響應(yīng)Cd脅迫，對構(gòu)樹進行Cd 處理，分析不同處理時間點該基因在根、莖、葉中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因在構(gòu)樹根、莖、葉中都表現(xiàn)出對Cd 脅迫的積極響應(yīng)，且具有一定的組織特異性（見圖5），這與其他基因在逆境中的表達具有相似性。如，耿芳等通過實時RT-PCR 分析a 基因在煙草中的表達，在干旱、高鹽的誘導(dǎo)下煙草（）中基因表達量明顯上調(diào)，后證明基因參與轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱和耐鹽的調(diào)控。同樣，才華等發(fā)現(xiàn)在大豆的根和葉中基因的表達均受鹽脅迫誘導(dǎo)，過表達基因的擬南芥對鹽脅迫的敏感性提高。王榮凱使用NaCl 脅迫嘎啦生根組培苗，組培苗根中表達受到明顯誘導(dǎo)，蘋果（）轉(zhuǎn)基因研究表明是蘋果抗逆的正調(diào)控因子。由此可見，基因可以響應(yīng)鎘脅迫，具有鎘脅迫耐受調(diào)控潛力。

為進一步快速確定基因?qū)d的響應(yīng)功能，本研究將轉(zhuǎn)入酵母，通過與對照酵母比較，分析其抗Cd 能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入基因的酵母INVSC1（pYES2-BpbZIP1）在CdCl脅迫下的生長活性顯著高于對照INVSC1（pYES2）（見圖6）。由于酵母表達系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于快速檢測基因的抗逆功能，如通過轉(zhuǎn)入和基因提高酵母對鹽、滲透及熱脅迫的耐受性，證明和能夠積極響應(yīng)非生物脅迫；用同樣的方法驗證了和在非生物脅迫反應(yīng)中的積極作用；Yang等通過將檉柳（）金屬硫蛋白在酵母中過表達，發(fā)現(xiàn)其能增強酵母的抗Cd、Zn、Cu和NaCl 能力，證明具有增強重金屬耐受性的作用；Jiang 等研究表明基因?qū)虢湍负螅D(zhuǎn)基因酵母在熱、鹽和氧化應(yīng)激條件下顯示出更高的生存力，證明基因的抗逆能力。本研究Cd 脅迫下的酵母生活力被基因的表達而顯著提高，表明的表達能有效改善轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd性，可以作為Cd 響應(yīng)的候選基因。在后續(xù)研究中，我們將通過植物表達系統(tǒng)對基因調(diào)控Cd脅迫的分子機制進行全面解析。