陳思思 謝牧洪 崔茂凱 李文凱 徐正剛 賈彩霞 楊桂燕

（西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西省經(jīng)濟植物資源開發(fā)利用重點實驗室，楊凌 712100）

近些年，由采礦、廢氣排放、污水灌溉、重金屬超標(biāo)制品濫用等人為因素致使含有重金屬的污水或者廢料排放到土壤里，導(dǎo)致土壤受到嚴(yán)重的重金屬污染。重金屬在土壤中能引起土壤成分、結(jié)構(gòu)和功能的改變，重金屬離子通過抑制作物根系生長和光合作用，使作物減產(chǎn)，糧食的生產(chǎn)面積縮小。更為嚴(yán)重的是，重金屬可以通過食物鏈轉(zhuǎn)移到動物和人體內(nèi)，嚴(yán)重危害動物和人的健康。隨著我國工業(yè)化進程加快，我國土壤重金屬污染問題日益加劇，在眾多重金屬污染中，鎘（Cd）被確認(rèn)為我國土壤的首要污染物。鎘在自然環(huán)境中具有化學(xué)活性強、移動性大、毒性持久、易富集等特點，因此受鎘污染土壤的治理難度很大。植物修復(fù)利用自然生長或遺傳工程培育的植物來修復(fù)重金屬污染土壤，是目前治理土壤污染的重要方法，具有較高的環(huán)保和經(jīng)濟價值。

構(gòu)樹（）是重要的扶貧攻堅樹種，具有生長迅速、環(huán)境適應(yīng)性強、分布廣泛、易于繁殖等優(yōu)良特性，也是尾礦區(qū)和重金屬污染地區(qū)的先鋒樹種和本土樹種，對多種重金屬元素具有良好的吸收和耐受力。但構(gòu)樹優(yōu)良品系的開發(fā)不夠，構(gòu)樹適應(yīng)重金屬的機理尚不清楚，這對發(fā)展構(gòu)樹生物修復(fù)不利。要充分發(fā)揮構(gòu)樹在重金屬土壤修復(fù)中的功能，其前提是掌握構(gòu)樹重金屬適應(yīng)機制，通過常規(guī)或分子育種培育Cd高抗高耐受型構(gòu)樹新品種。因此，本研究旨在鑒定構(gòu)樹重要的Cd響應(yīng)基因，為開展構(gòu)樹抗Cd分子育種提供候選基因。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）是真核生物中重要的調(diào)控蛋白。在植物中，轉(zhuǎn)錄因子是許多信號網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控因子，如植物生長、生物或非生物脅迫等。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）是轉(zhuǎn)錄因子中重要的蛋白質(zhì)家族之一。植物中的bZIP 一般由60～80 個氨基酸殘基組成，含有1 個堿性結(jié)構(gòu)域和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，氨基酸殘基組成的堿性結(jié)構(gòu)域與特異DNA 序列相結(jié)合，起核定位信號作用，亮氨酸拉鏈形成兩親性的α 螺旋結(jié)構(gòu)，參與bZIP 蛋白與DNA 結(jié)合之前的二聚體化。在前期對構(gòu)樹響應(yīng)Cd 脅迫的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究中，我們獲得了受Cd 脅迫上調(diào)表達(dá)的眾多基因，其中包括堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zip?per，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族中的若干成員。

現(xiàn)代分子生物研究顯示，bZIP 是植物生長過程的重要調(diào)節(jié)劑，如組織分化、細(xì)胞伸長、病原體防御、激素信號傳導(dǎo)、光反應(yīng)以及滲透控制。針對bZIP 調(diào)控植物抗逆的研究顯示，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可參與抗病、抗寒、抗旱、耐鹽和抗重金屬離子等多種逆境脅迫調(diào)控。如，水稻（）中過表達(dá)顯著提高了植株對干旱、鹽和PEG 滲透脅迫的耐受性，鋅鐵轉(zhuǎn)運蛋白基因和參與水稻Zn和CdCl的吸收和轉(zhuǎn)運；大豆（）參與大豆耐藥性、耐鹽性、干旱耐受性的調(diào)控；苧麻（）在響應(yīng)高鹽脅迫時起正向調(diào)控作用，在植物響應(yīng)干旱和重金屬Cd 脅迫時起負(fù)向調(diào)控作用。因此，本研究對響應(yīng)Cd脅迫表達(dá)較為突出的1個bZIP成員（命名為）進行Cd脅迫下的表達(dá)和轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd分析，以期為揭示構(gòu)樹Cd適應(yīng)分子機制和抗逆分子育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

植物材料：同批次構(gòu)樹組培苗轉(zhuǎn)移至土壤生長至2年。

處理方法：使用分析純的CdCl配置150 μmol·L的CdCl溶液，對構(gòu)樹進行脅迫處理，在處理后0、3、12、24、48、72 h 等時間點分別取根、莖、葉，將根、莖、葉用液氮速凍后，于冰箱中-80℃保存?zhèn)溆?，每個處理包含5棵植株。

1.2 BpbZIP1基因的克隆與分析

在以構(gòu)樹Cd 脅迫下的轉(zhuǎn)錄組篩選出的上調(diào)表達(dá)基因中，篩選bZIP 家族成員，選擇其中1 條表達(dá)值較高的基因（命名為）進行分析?；虻拈_放讀碼框（ORF）用ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）確定。根據(jù)基因ORF 兩端序列設(shè)計引物-和-（見表1），進行PCR 擴增。產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pMD-18T 載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取陽性克隆擴大培養(yǎng)進行菌液PCR驗證，對可獲得目的片段的克隆測序。

表1 本研究涉及引物Table 1 The primers used in the study

利用Expasy ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對確認(rèn)的基因序列特征進行分析。利用BLASTP（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast）進行序列同源性搜索。利用MEGA7 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。使用ClustalX 進行蛋白質(zhì)多序列比對。使用CD-Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc?ture/cdd/wrpsb. cgi）和MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）進行BpbZIP1 的保守結(jié)構(gòu)域分析。利用在線軟件SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）推 測BpbZIP1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，利用Swiss Model（https：//swissmod?el.expasy.org/）推測BpbZIP1 蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bio?inf/Cell-PLoc-2/）進行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.3 BpbZIP1基因的表達(dá)分析

對1.1 中收集樣品進行基因表達(dá)量分析。RNA 提取采用CTAB 法進行，RNA 經(jīng)DNA 消化酶處理后采用PrimeScriptRT reagent Kit（CWBIO，康為世紀(jì)，中國）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，稀釋10倍后用作qRT-PCR 的模板。qRT-PCR使用SYBR Green Real time PCR Master mix（CWBIO）進行，內(nèi)參基因為。所用引物如表1所示，定量引物為DL-F和DL-R。定量反應(yīng)所用儀器為Applied Biosystems生產(chǎn)的StepOneReal Time PCR System。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性12 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，45個循環(huán)；81 ℃讀板1 s，每個樣品重復(fù)3次。采用2法對定量結(jié)果進行相對分析，表示為相對于內(nèi)參基因相對于對照的表達(dá)值。數(shù)據(jù)使用SPSS 軟件包（SPSS，Chicago，Illinois，USA）分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。不同時間點與0 h之間的表達(dá)差異用檢驗分析（<0.05）。

1.4 酵母表達(dá)載體構(gòu)建及脅迫分析

根據(jù)基因序列特征及pYES2 酶切位點特性設(shè)計酵母表達(dá)載體引物BpbZIP1-JM-F 和BpbZIP1-JM-R（見表1）。通過PCR 反應(yīng)獲得含有酶切位點的序列，經(jīng)酶切純化后與pYES2連接獲得重組載體pYES2-BpbZIP1。將pYES2-BpbZIP1 和空pYES2 載體分別轉(zhuǎn)入酵母INVSC1中，分別記為INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2），后者為對照。本研究所用工具酶均為寶生物（Takara）公司產(chǎn)品。

分 別 挑 取INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和IN?VSC1（pYES2）單克隆置于含2%葡萄糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，30℃震蕩培養(yǎng)16 h，收集酵母菌體重懸于含2%半乳糖的SC-Ura液體培養(yǎng)基中，且調(diào)整OD=0.5，30℃繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至OD=1.8，分別收集菌體進行Cd 脅迫處理。即，取相同量的上述INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）菌體，分別在含有0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0% CdCl的SC-Ura 液體培養(yǎng)基（含2%葡萄糖）中震蕩培養(yǎng)30 h，測定酵母生長活性（OD）。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件包分析。樣品變異性用標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。相同處理下INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）之間的差異顯著性用檢驗分析（<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 BpbZIP1基因基本生物信息

通過對構(gòu)樹轉(zhuǎn)錄組篩查鑒定獲得基因（GeneBank 登錄號：MW567468），根據(jù)獲得的cDNA 序列設(shè)計引物BpbZIP1-F/R 進行PCR 驗證，確定該基因序列ORF長1 713 bp，編碼的蛋白包含570 個氨基酸，分子量為62 902.38 Da，等電點為4.62。保守域分析發(fā)現(xiàn)該蛋白有bZIP 結(jié)構(gòu)域（見圖1）。Swiss Model 同源建模預(yù)測的BpbZIP1 蛋白三維結(jié)構(gòu)是典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（見圖2：A～B），BpbZIP1 二級結(jié)構(gòu)的主要構(gòu)成元件為無規(guī)則卷曲和螺旋，占總氨基酸的48.95% 和39.12%，其余延伸鏈和轉(zhuǎn)角分別占8.25%、3.68%（見圖2C）。經(jīng)同源搜索并進行進化分析，顯示BpbZIP1蛋白與擬南芥（）ZIP同源，且與AtbZIP1 的進化關(guān)系較近（見圖3）。將BpbZIP1蛋白與擬南芥同源蛋白進行多序列對比，顯示出高度的相似性（見圖4A），同時BpbZIP1 蛋白與擬南芥同源蛋白都具有相同的保守結(jié)構(gòu)域（見圖4B）。對BpbZIP1 蛋白進行亞細(xì)胞定位預(yù)測，顯示BpbZIP1蛋白為核蛋白。

圖1 BpbZIP1蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.1 The conserved domain of BpbZIP1 protein

圖2 BpbZIP1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測A.與非冗余PDB（Protein Data Bank）結(jié)構(gòu)集比較；B.三維結(jié)構(gòu)模型；C.二級結(jié)構(gòu)；h.α螺旋；e.延伸鏈；t.β轉(zhuǎn)角；c.無規(guī)則卷曲Fig.2 Predicted structure of BpbZIP1 protein A.Comparison with non-redundant set of PDB（Protein Data Bank）structures；B.3D structure model；C.Secondary structure；h. α helix；e.Extended strand；t.Beta turn；c.Random coil

圖3 BpbZIP1與擬南芥相似蛋白的進化樹括號內(nèi)為登錄號；Bb.構(gòu)樹；At.擬南芥Fig.3 Phylogenetic tree of BpbZIP1 protein GeneBank accession number in brackets；Bb.B.papyrifera；At.A.thaliana

2.2 BpbZIP1基因在Cd脅迫下的表達(dá)

提取CdCl脅迫不同時間點的根、莖、葉的總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 用作qRT-PCR 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因能被Cd 脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，且在根、莖、葉中具有一定差異（見圖4）。在根中，基因受脅迫后迅速被誘導(dǎo)，在3 h 達(dá)到最高水平，為對照組的17.4 倍；之后表達(dá)水平逐漸下降，但72 h 仍處于上調(diào)表達(dá)。在莖中，基因隨時間延長的表達(dá)變化趨勢同根中表現(xiàn)相似，均為倒‘V’字形，但整體上根中的表達(dá)要高于莖中的表達(dá)，且莖中出現(xiàn)的峰值在12 h，為對照的5.6 倍。在葉中，基因的轉(zhuǎn)錄水平隨脅迫時間延長不斷升高，在72 h為對照的5.1倍（見圖5）。

圖4 BpbZIP1與擬南芥同源蛋白多序列對比（A）及其motif（B）Fig.4 Multiple sequence alignment of BpbZIP1 and A.thaliana homologous proteins（A）and its motif logos（B）

圖5 BpbZIP1基因在Cd處理下的表達(dá)水平**，*分別表示同一組織在不同時間點與0 h 之間的差異極顯著（P<0.001）和顯著（P<0.05）Fig.5 The expression level of BpbZIP1 gene under different time of CdCl2 treatment**，* mean that the difference between the same tissue at different time points and 0 h was extremely significan（tP<0.001）and signifi?can（tP<0.05）

2.3 BpbZIP1基因表達(dá)對酵母抗Cd性的影響

分 別 挑 取INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和IN?VSC1（pYES2）單克隆在相同條件下培養(yǎng)并進行不同CdCl濃度處理，比較二者在Cd 脅迫下的生長活性。結(jié)果顯示，在非脅迫條件下，INVSC1（pY?ES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）的生長沒有明顯區(qū)別，但在CdCl脅迫處理后，INVSC1（pYES2-Bp?bZIP1）和INVSC1（pYES2）的OD明顯下降，且隨著CdCl濃度增加，INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）的OD逐漸變小，但I(xiàn)NVSC1（pY?ES2-BpbZIP1）一直高于INVSC1（pYES2），且差異顯著（見圖6）。表明基因的表達(dá)顯著改善了酵母的CdCl脅迫性能。

圖6 轉(zhuǎn)BpbZIP1基因酵母在鎘脅迫下的OD600**表示相同處理條件下INVSC1（pYES2-BpbZIP1）和INVSC1（pYES2）之間的差異性顯著性（P<0.01）Fig.6 The OD600 of BpbZIP1 transgenic yeasts under different CdCl2 concentrations** indicates the significant difference between INVSC1（pYES2-BpbZIP1）and INVSC1（pYES2）under the same treatment conditions（P<0.01）

3 討論

植物修復(fù)（Phytoremediation）是一種利用自然生長植物或者遺傳工程培育植物修復(fù)金屬污染土壤環(huán)境的技術(shù)，是一種經(jīng)濟、高效的方法。超級積累植物可以從土壤中吸取金屬污染物以達(dá)到降低或去除土壤重金屬污染的目的。目前發(fā)現(xiàn)的重金屬超積累植物已經(jīng)多達(dá)700 多種，如，我國東南景天（）為Cd 和Zn 超級積累植物；土荊芥（）為Pb 超級積累植物；商陸（）能大量富集Cd；蕁麻（）對Zn有較強富集能力?？梢姡参镌谥亟饘僦卫磉^程中可以發(fā)揮重要作用，發(fā)展植物修復(fù)方法可行性強。構(gòu)樹以其突出的經(jīng)濟價值和優(yōu)良的生態(tài)適應(yīng)性受到廣泛關(guān)注。商侃侃等分析了54 種木本植物對土壤Cu、Pb、Zn 的提取能力，結(jié)果表明構(gòu)樹具有較強的金屬離子綜合提取能力。金裕華等研究表明構(gòu)樹在重金屬污染土壤中適應(yīng)性較強、生長良好。曾鵬等研究顯示蘆竹（）與構(gòu)樹、桑樹（）間種可有效用于重金屬污染土壤修復(fù)。可見，充分掌握構(gòu)樹的重金屬響應(yīng)分子機制，能為更好地應(yīng)用構(gòu)樹于重金屬污染修復(fù)提供依據(jù)。

本研究鑒定獲得的基因與擬南芥bZIP的較多成員具有較近的親緣關(guān)系（見圖3），其中與的進化關(guān)系較近；是一個糖調(diào)控基因，介導(dǎo)糖信號，影響基因的表達(dá)和植物的生長發(fā)育。且Sun 等研究證明參與植物生物調(diào)控，發(fā)現(xiàn)其為植物耐鹽、耐滲透和耐鹽性的正向調(diào)節(jié)因子。參與植物中活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而ROS 作為信號分子調(diào)控植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)。是葡萄糖-ABA 相互作用網(wǎng)絡(luò)的重要節(jié)點，根據(jù)糖的供應(yīng)情況參與ABA介導(dǎo)的非生物脅迫響應(yīng)調(diào)節(jié)。所以，我們初步認(rèn)為基因可能與植物非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)。

為進一步明確基因是否能響應(yīng)Cd脅迫，對構(gòu)樹進行Cd 處理，分析不同處理時間點該基因在根、莖、葉中的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因在構(gòu)樹根、莖、葉中都表現(xiàn)出對Cd 脅迫的積極響應(yīng)，且具有一定的組織特異性（見圖5），這與其他基因在逆境中的表達(dá)具有相似性。如，耿芳等通過實時RT-PCR 分析a 基因在煙草中的表達(dá)，在干旱、高鹽的誘導(dǎo)下煙草（）中基因表達(dá)量明顯上調(diào)，后證明基因參與轉(zhuǎn)基因擬南芥耐旱和耐鹽的調(diào)控。同樣，才華等發(fā)現(xiàn)在大豆的根和葉中基因的表達(dá)均受鹽脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)基因的擬南芥對鹽脅迫的敏感性提高。王榮凱使用NaCl 脅迫嘎啦生根組培苗，組培苗根中表達(dá)受到明顯誘導(dǎo)，蘋果（）轉(zhuǎn)基因研究表明是蘋果抗逆的正調(diào)控因子。由此可見，基因可以響應(yīng)鎘脅迫，具有鎘脅迫耐受調(diào)控潛力。

為進一步快速確定基因?qū)d的響應(yīng)功能，本研究將轉(zhuǎn)入酵母，通過與對照酵母比較，分析其抗Cd 能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入基因的酵母INVSC1（pYES2-BpbZIP1）在CdCl脅迫下的生長活性顯著高于對照INVSC1（pYES2）（見圖6）。由于酵母表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于快速檢測基因的抗逆功能，如通過轉(zhuǎn)入和基因提高酵母對鹽、滲透及熱脅迫的耐受性，證明和能夠積極響應(yīng)非生物脅迫；用同樣的方法驗證了和在非生物脅迫反應(yīng)中的積極作用；Yang等通過將檉柳（）金屬硫蛋白在酵母中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其能增強酵母的抗Cd、Zn、Cu和NaCl 能力，證明具有增強重金屬耐受性的作用；Jiang 等研究表明基因?qū)虢湍负?，轉(zhuǎn)基因酵母在熱、鹽和氧化應(yīng)激條件下顯示出更高的生存力，證明基因的抗逆能力。本研究Cd 脅迫下的酵母生活力被基因的表達(dá)而顯著提高，表明的表達(dá)能有效改善轉(zhuǎn)基因酵母的抗Cd性，可以作為Cd 響應(yīng)的候選基因。在后續(xù)研究中，我們將通過植物表達(dá)系統(tǒng)對基因調(diào)控Cd脅迫的分子機制進行全面解析。