程 赫 田雙慧 張 洋 劉 聰 夏德安 魏志剛

（1. 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150040；2. 國(guó)家林業(yè)和草原局鹽堿地研究中心，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，北京 100091）

非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（non-specific lipid transfer proteins，nsLTP）廣泛存在于高等植物中，是一類在體外膜之間介導(dǎo)磷脂轉(zhuǎn)移的堿性蛋白，具有8個(gè)保守的半胱氨酸基序（C-Xn-C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C，8 CM）（其中的二硫鍵能形成穩(wěn)定的疏水結(jié)構(gòu)），是其參與結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)各種脂質(zhì)（如脂肪酰輔酶A、磷脂和脂肪酸等）的調(diào)控活性中心。nsLTP蛋白于1975年首次在馬鈴薯（）發(fā)芽塊莖中被發(fā)現(xiàn)，隨后，在油菜（）、黃瓜（）和火炬松（）等多種植物中相繼克隆出。根據(jù)其編碼蛋白分子量、序列相似和脂質(zhì)轉(zhuǎn)移效率的差異性，植物nsLTP 可分為nsLTP1（8～10 kDa）和nsLTP2（約7 kDa）2種類型，其中nsLTP1 型的疏水腔呈隧道狀，而nsLTP2 型則呈三角形的空心狀。

研究發(fā)現(xiàn)，植物參與細(xì)胞壁松弛和延伸、花藥和花粉的發(fā)育與萌發(fā)等生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，如被家族沉默的水稻（）花粉外壁發(fā)育缺陷、花粉育性降低，玉米（）nsLTP 蛋白能與一種鈣調(diào)素結(jié)合蛋白相互作用，從而調(diào)節(jié)自身的生理活性。同時(shí)，植物在生物與非生物脅迫響應(yīng)中也能發(fā)揮重要作用，如過(guò)表達(dá)小鹽芥（）的轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫下生物量和葉綠素值顯著高于野生型植株。擬南芥（）脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AZI1 不僅能與蛋白激酶MPK3相互作用形成復(fù)合物，也能夠被MPK3 上調(diào)表達(dá)，從而介導(dǎo)其鹽脅迫響應(yīng)。此外，植物對(duì)脫落酸、水楊酸、赤霉毒和乙烯等激素脅迫也具有響應(yīng)性，如馬鈴薯中在水楊酸、茉莉酸和脫落酸的誘導(dǎo)下表達(dá)量有明顯的上調(diào)趨勢(shì)。

先前研究已經(jīng)在擬南芥、水稻和小麥（）等模式植物中分別鑒定出了49、52、106 個(gè)基因并對(duì)其進(jìn)行了全基因組分析。由于8 個(gè)保守的半胱氨酸的結(jié)構(gòu)不同，被分為9 大類、被分為10 類，且處于相同類別的基因在多條染色體上形成了基因簇，說(shuō)明該基因家族的擴(kuò)增主要是由串聯(lián)復(fù)制事件演化而來(lái)；結(jié)構(gòu)分析表明該家族內(nèi)含子—外顯子結(jié)構(gòu)多樣性較低，多數(shù)基因無(wú)內(nèi)含子；在鹽和干旱脅迫條件下家族基因被上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明該家族基因在響應(yīng)逆境脅迫方面可能具有重要的功能。毛果楊（）作為首個(gè)全基因組測(cè)序的木本植物，是研究木材形成、季節(jié)性生長(zhǎng)、性別分化以及木本植物逆境脅迫響應(yīng)的模式植物。然而，目前為止，尚未見(jiàn)家族基因的研究報(bào)導(dǎo)。本項(xiàng)研究從全基因組水平對(duì)家族成員的基因數(shù)量、親緣關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位、編碼蛋白保守基序分布與數(shù)量等特征進(jìn)行研究。同時(shí)，利用qRT-PCR 技術(shù)并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)其組織與逆境脅迫響應(yīng)特性進(jìn)行初步研究。本項(xiàng)研究將為在楊樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫下的生物學(xué)功能分析與鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 PtrnsLTP 家族成員的確定以及系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了鑒定毛果楊基因家族的成員，首先利用已知的擬南芥家族各基因編碼氨基酸序列在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進(jìn)行搜索，將獲得的序列結(jié)果匯總整理，剔除重復(fù)序列后作為候選基因。為了驗(yàn)證初始結(jié)果的可靠性，將候選基因的氨基酸序列上傳至HMMER 網(wǎng)站（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/）以及NCBI 保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）鑒定其是否具有家族保守結(jié)構(gòu)域。通過(guò)上述步驟，初步確定家族包含39個(gè)基因。

下載和編碼的氨基酸序列，通過(guò)MEGA6.0 軟件中的鄰接法（Neighbor-joining，NJ），校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap 重復(fù)10 000 次，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，隨后在iTOL（https：//itol.embl.de/）網(wǎng)站上對(duì)生成的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化處理。

利用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）在線預(yù)測(cè)PtrnsLTP 蛋白理化性質(zhì)，包括氨基酸數(shù)目、分子量和等電點(diǎn)等；從Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取該基因家族的染色體位置、基因序列、氨基酸序列、開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度以及氨基酸長(zhǎng)度等信息，并根據(jù)基因所在的染色體號(hào)以及位置對(duì)其命名；通過(guò)Plant-mPLoc（http：//www. csbio. sjtu. edu. cn/bioinf/plant-multi/）網(wǎng)站，在線預(yù)測(cè)家族成員的亞細(xì)胞定位信息。

1.2 同源基因的Ka和Ks分析

通過(guò)Blastp 比對(duì)氨基酸序列，利用TBtools 軟件分析同源基因?qū)χg的Ka（異意替換）和Ks（同意替換）以及二者的比率。這個(gè)比率可以判斷是否有選擇壓力作用于這個(gè)蛋白質(zhì)編碼的基因。若Ka/Ks=1 則同義突變和非同義突變將以同樣的速率被固定，即中性選擇，突變不會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；若Ka/Ks＞1，氨基酸發(fā)生了改變，此時(shí)的非同義突變會(huì)提高植物的生存力，即正選擇；只有當(dāng)Ka/Ks＜1 時(shí)，非同義突變是有害的，即負(fù)選擇，使得突變具有純化作用。

1.3 PtrnsLTP的結(jié)構(gòu)及保守基序分析

通過(guò)GSDS 網(wǎng)站（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/in?dex.php）將的內(nèi)含子和外顯子信息進(jìn)行可視化，并結(jié)合MEGA6.0 軟件對(duì)其進(jìn)化樹(shù)文本進(jìn)行基因進(jìn)化樹(shù)比對(duì)分析。

利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）網(wǎng)站對(duì)PtrnsLTP 氨基酸序列進(jìn)行保守基序分析，TBtools軟件對(duì)該分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.4 PtrnsLTP組織表達(dá)鹽脅迫響應(yīng)特性分析

組織表達(dá)特異性分析：通過(guò)Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)，下載各在各組織中的表達(dá)量數(shù)據(jù)，并與qRT-PCR 分析結(jié)果相互驗(yàn)證。野生型毛果楊來(lái)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所，用組織培養(yǎng)的方法擴(kuò)繁后。將1 月大小的組培苗移栽到土壤中，在25 ℃、長(zhǎng)日照（光照16 h 黑暗8 h）環(huán)境下溫室中培養(yǎng)3 周。分別采集根、莖和葉組織，利用植物總RNA 提取試劑盒（MiniBEST，TaKaRa）提取總RNA，然后采用PrimeScriptRT reagent Kit（Per?fect Real Time，TaKaRa）試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA 獲得cDNA 用于qRT-PCR。每組處理重復(fù)3 次，采用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并利用TBtools可視化。

鹽脅迫下的響應(yīng)特性：將幼苗隨機(jī)分成7 組，每組包含5 棵毛果楊幼苗。用100 mmol?LNaCl處理3、6、12、24、48、72 h 同時(shí)用水處理作為對(duì)照組。分別采集上述處理組內(nèi)各植株材料的根、莖和葉組織，提取總RNA 后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 進(jìn)行qRT-PCR 分析。每組處理重復(fù)3 次，采用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量并利用TBtools可視化。

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)家族基因定量引物，以為內(nèi)參基因（見(jiàn)表1）。在賽默飛ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行試驗(yàn)，體系如下：2×TransStart TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、上下游混合引物（10 μmol·L）0.4 μL、cDNA1.5 μL，PassiveReference Dye（50×）0.4 μL，加ddHO 至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃30 s；94 ℃5 s，60 ℃15 s，72 ℃35 s，循環(huán)40次；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃30 s。

表1 PtrnsLTP定量引物序列Table 1 PtrnsLTP quantitative primer sequence

2 結(jié)果分析

2.1 PtrnsLTP系統(tǒng)進(jìn)化

以家族基因序列為參考，在毛果楊基因組中鑒定出39個(gè)，其編碼蛋白均含有植物nsLTP 典型的C--C-Xn-CC-Xn-CXC-Xn-C-Xn-C保守結(jié)構(gòu)域。為了進(jìn)一步分析家族成員間進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建了毛果楊和擬南芥編碼的蛋白序列進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（見(jiàn)圖1）表明：毛果楊與擬南芥可分為5 個(gè)亞家族，不同的亞家族間用不同的背景顏色表示，同時(shí)外部的黑色和白色圓圈分別代表毛果楊及擬南芥nsLTP 家族基因。可以看出A 亞族有6 個(gè)、B 亞族有2 個(gè)、C 亞族有13 個(gè)、D 亞族有3 個(gè)、E 亞族有15 個(gè)成員，與其他物種的進(jìn)化方式相似。

圖1 擬南芥和毛果楊nsLTP基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)黑色圓圈標(biāo)記PtrnsLTP，白色圓圈標(biāo)記AtnsLTPFig.1 Phylogenetic tree of Arabidopsis thaliana and P.trichocarpa nsLTP gene family PtrnsLTP is marked with a black circle，AtnsLTP is marked with a white circle

2.2 PtrnsLTP基本特征

家族各基因編碼蛋白分子質(zhì)量為8.58～16.95 kDa、pI 值為4.27～9.91，符合植物家族基因編碼蛋白的等電點(diǎn)基本特征（見(jiàn)表2）。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，編碼蛋白如PtrnsLTP1.1等14 個(gè)蛋白定位在細(xì)胞膜上，PtrnsLTP1.3等22個(gè)蛋白定位在細(xì)胞壁上，其中PtrnsLTP9.2、PtrnsLTP11.1和PtrnsLTP15.1在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁上均有定位。

表2 PtrnsLTP家族概況Table 2 Overview of the PtrnsLTP gene family

2.3 PtrnsLTP的染色體定位及序列一致性

為了闡明家族基因在染色體上的分布，利用TBtools 構(gòu)建了家族基因染色體定位以及同源關(guān)系圖。結(jié)果（見(jiàn)圖2）表明，主要分布在毛果楊1 號(hào)和16 號(hào)染色體上，各有6 個(gè)且16號(hào)染色體上的6 個(gè)基因形成了基因簇。4、9、11、12和14號(hào)染色體上各有3個(gè)，2、7、10、15和17號(hào)染色體上各有2個(gè)，其余染色體上均只含有1個(gè)基因。

圖2 PtrnsLTP染色體定位及序列一致性Fig.2 Chromosome location and sequence identity analysis of PtrnsLTP

Blastp 結(jié) 果 顯 示，和與同源片段長(zhǎng)度大于300 bp且序列一致性高于80%，同樣的還有和、和、和、和（見(jiàn)圖3，表3），說(shuō)明這7 對(duì)基因?yàn)榛驈?fù)制事件進(jìn)化而形成的旁系同源基因。

圖3 PtrnsLTP家族基因外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)Fig.3 Exon-intron structure of PtrnsLTP family gene

表3 同源基因的Ka/Ks比值及序列一致性Table 3 Ka/Ks ratio and sequence identity of homologous genes

同源基因Ka/Ks 分析發(fā)現(xiàn)，家族共有7 對(duì)同源基因，其中6 對(duì)基因（和、和、和、和、和、和）的Ka/Ks 比值小于1，1 對(duì)（和）大于1（見(jiàn)表3），上述結(jié)果表明，家族各成員在進(jìn)化過(guò)程中大多數(shù)基因經(jīng)過(guò)了純化選擇，少部分基因受到了正向選擇。值得注意的是這6 對(duì)基因處于同一個(gè)大的進(jìn)化分支上，推測(cè)進(jìn)化壓力的不同可能會(huì)導(dǎo)致基因功能的分化。

2.4 PtrnsLTP 外顯子和內(nèi)含子分布以及編碼蛋白結(jié)構(gòu)域

為了更好地闡明家族中各基因外顯子與內(nèi)含子分布規(guī)律，利用GSDS網(wǎng)站對(duì)上述內(nèi)容進(jìn)行了可視化處理。結(jié)果表明（見(jiàn)圖3），不同基因的內(nèi)含子與外顯子在基因中的分布方式相似，所有基因均無(wú)內(nèi)含子，表明家族基因的結(jié)構(gòu)在進(jìn)化中極為保守。

家族編碼蛋白保守域分析發(fā)現(xiàn)，9 個(gè)保守基序中Motif 1 和Motif 2 為家族共有基序（見(jiàn)圖4）。雖然不同基因編碼蛋白所含基序數(shù)量與種類存在一定的差異，但相同分枝的基因編碼蛋白具有相似的基序組合，而不同亞家族、類型之間的基序存在明顯的差別。上述結(jié)果表明，不同亞家族的生物學(xué)功能在進(jìn)化過(guò)程中可能產(chǎn)生了分化。

圖4 PtrnsLTP蛋白的保守基序分析Motif 1～9用不同的顏色表示；Motif 1～4序列展示在下方Fig.4 Conserved motif analysis of PtrnsLTP protein Motif 1～9 are represented by different colors，and Motif 1～4 sequences are shown below

2.5 PtrnsLTP組織表達(dá)特異性

為了解家族各成員在毛果楊生長(zhǎng)發(fā)育中的生物學(xué)功能，我們對(duì)Phytozome 中家族各基因在不同組織部位的表達(dá)量數(shù)據(jù)并進(jìn)行了初步分析，結(jié)果（見(jiàn)圖5A）表明，家族成員在毛果楊各組織表達(dá)量不同，其中除、、、、、以 及在網(wǎng)站無(wú)表達(dá)量數(shù)據(jù)以外，其余基因均在毛果楊不同部位有所表達(dá)。該家族大部分基因在莖部表達(dá)量較高，其次為葉部，相同進(jìn)化分枝基因的表達(dá)模式相似。同時(shí)，我們利用qRT-PCR 技術(shù)對(duì)家族成員在毛果楊不同組織部的表達(dá)情況做進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果（見(jiàn)圖5B）表明，各家族成員在毛果楊根、莖和葉中的表達(dá)變化趨勢(shì)與phytozome 中各基因表達(dá)值基本吻合。上述結(jié)果初步表明，家族成員在毛果楊根、莖和葉發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能產(chǎn)生了分化。

圖5 PtrnsLTP組織表達(dá)特異性A.Phytozome網(wǎng)站數(shù)據(jù)；B.qRT-PCR結(jié)果Fig.5 PtrnsLTP tissue expression specificity A.Phytozome website data；B.qRT-PCR results

2.6 PtrnsLTP對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)特性

為鑒定家族成員的鹽脅迫響應(yīng)特性，利用qRT-PCR 技術(shù)分析了不同時(shí)間鹽脅迫下家族成員在毛果楊根、莖、葉部的表達(dá)量。結(jié)果（見(jiàn)圖6）表明，39個(gè)成員均對(duì)鹽脅迫有不同程度的響應(yīng)；根部組織中，隨著鹽脅迫時(shí)間的增加，除、、和表達(dá)量降低以外，其余基因表達(dá)量均有明顯的上升趨勢(shì)；莖部幾乎所有基因表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)明顯的先升高后降低的“倒U”曲線趨勢(shì)，即隨著脅迫時(shí)間的增加表達(dá)量先升高，達(dá)到峰值后逐漸降低；同樣，葉部相同進(jìn)化分支的基因如、和表達(dá)量也在12 h 時(shí)達(dá)到了峰值，而其他大部分基因表達(dá)量隨脅迫時(shí)間增加呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)。

圖6 PtrnsLTP在鹽脅迫不同時(shí)間下的表達(dá)特性Fig.6 Expression characteristics of PtrnsLTP under salt stress at different times

3 討論

脂質(zhì)（磷脂）在維持植物細(xì)胞功能、生長(zhǎng)發(fā)育以及各種脅迫的應(yīng)答中起著重要作用，而nsLTP蛋白是植物體內(nèi)脂質(zhì)（磷脂和脂肪酸）跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體。研究表明，植物nsLTP 對(duì)干旱、鹽堿和低溫等非生物脅迫具有較強(qiáng)的響應(yīng)能力。目前為止，植物家族基本特性的研究主要集中在水稻和擬南芥等草本模式植物中，木本模式植物毛果楊家族的研究目前尚無(wú)報(bào)導(dǎo)。

3.1 PtrnsLTP家族基因基本特性

本項(xiàng)研究在毛果楊基因組中鑒定出39 個(gè)，按照進(jìn)化關(guān)系將其分為5 個(gè)亞組族（見(jiàn)圖1），其編碼蛋白分別定位在細(xì)胞壁、細(xì)胞膜或在二者之間均有定位（見(jiàn)表2）。家族成員分布于毛果楊14 條染色體上，且各染色體上基因分布數(shù)量存在差異，其中1 號(hào)和16 號(hào)染色體上分布最多，分別有6 個(gè)（見(jiàn)圖2），而6 和8 號(hào)染色體上均只含有1個(gè)基因，表明導(dǎo)致家族成員擴(kuò)張的歷史事件存在差異。家族中有7 對(duì)基因?yàn)榕韵低椿颍ㄒ?jiàn)圖2 和表3），其中1 對(duì)旁系同源基因的Ka/Ks 比值大于1，證明其受到了正向選擇，6 對(duì)遠(yuǎn)小于1，且這6 對(duì)基因處于同一個(gè)大的進(jìn)化分支。該家族基因在進(jìn)化過(guò)程當(dāng)中既經(jīng)歷了純化選擇也經(jīng)歷了正向選擇，有害的非同義替換在進(jìn)化過(guò)程中消失，極少數(shù)的無(wú)害或有益替換得以保留，上述結(jié)果表明，毛果楊家族基因在進(jìn)化過(guò)程受到的選擇作用不同，因此其家族基因編碼蛋白的細(xì)胞定位與理化性狀產(chǎn)生了分化。同時(shí)，這一現(xiàn)象也預(yù)示了該基因家族的生物學(xué)功能產(chǎn)生了分化。家族基因均無(wú)內(nèi)含子（見(jiàn)圖3），一般認(rèn)為無(wú)內(nèi)含子基因能夠連續(xù)編碼成蛋白質(zhì)，且內(nèi)含子與真核生物基因組的復(fù)雜程度有很大的關(guān)系，越復(fù)雜的生物體其體內(nèi)的內(nèi)含子數(shù)越多。此外近期研究表明，無(wú)內(nèi)含子基因能夠更加快速的應(yīng)答脅迫信號(hào)，預(yù)示著該家族基因在非生物脅迫下可能具有重要功能。與其他植物一樣，家族編碼蛋白含有多個(gè)基序，表明該基因家族生物學(xué)功能的多樣性，但所有基因均含有保守基序Motif 1 和Motif 2（見(jiàn)圖4），表明這兩個(gè)基序是該家族的特征基序，且是毛果楊生命活動(dòng)所必需的。上述結(jié)果進(jìn)一步預(yù)示了家族結(jié)構(gòu)相對(duì)較為保守，但不同進(jìn)化分枝基因可能在生物學(xué)功能上出現(xiàn)了分化。

3.2 PtrnsLTP家族基因參與鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程

結(jié)合毛果楊生物學(xué)網(wǎng)站表達(dá)譜數(shù)據(jù)（見(jiàn)圖5A）與本研究中qRT-PCR 結(jié)果（見(jiàn)圖5B）發(fā)現(xiàn)，家族成員在毛果楊根、莖和葉部均有表達(dá)，但表達(dá)量在3 種組織中存在差異，其中11 個(gè)基因在根部表達(dá)水平較高，15 個(gè)在莖部表達(dá)水平較高，13個(gè)在葉部表達(dá)水平較高，預(yù)示了各成員分別在毛果楊不同組織發(fā)育過(guò)程中扮演著不同的作用。前期研究表明，多涉及環(huán)境脅迫響應(yīng)，而鹽脅迫又是最常見(jiàn)的環(huán)境脅迫之一。鹽脅迫過(guò)程主要分為兩部分即滲透脅迫和離子脅迫，滲透脅迫是植物在鹽漬土壤中經(jīng)歷的第1次脅迫，當(dāng)鹽濃度達(dá)到臨界值時(shí)就會(huì)產(chǎn)生離子毒害。我們利用qRT-PCR 分析毛果楊在鹽脅迫不同時(shí)間下的表達(dá)情況（見(jiàn)圖6），結(jié)果進(jìn)一步表明，家族基因?qū)}脅迫具有不同程度的響應(yīng)能力，與擬南芥中該家族在鹽脅迫中表現(xiàn)類似。值得注意的是莖部幾乎所有的基因在鹽脅迫12 h時(shí)表達(dá)水平顯著上升，而莖部又是輸送水、無(wú)機(jī)鹽以及有機(jī)物等維持植物體正常生長(zhǎng)必不可少成分的關(guān)鍵部位。據(jù)此，我們推測(cè)該家族基因可能在植物鹽脅迫中主要參與滲透脅迫過(guò)程。

本研究通過(guò)對(duì)家族基因生物學(xué)功能的鑒定和鹽脅迫表達(dá)特征分析為今后更深入了解該基因家族奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)基因資源的挖掘具有積極的意義。