杜玉蘭，嚴(yán)建剛，李曉敏，喻勤，李翠華，毛新亮

1(完美(廣東)日用品有限公司，廣東 中山,528451)2(廣東完美生命健康科技研究院有限公司，廣東 中山,528451)

大豆蛋白食品具有保健、預(yù)防相關(guān)疾病的功效，諸如調(diào)節(jié)人體血脂，降低膽固醇、脂肪肝，減少患心血管病的危險(xiǎn)，預(yù)防膽結(jié)石的形成；調(diào)節(jié)人體鈣質(zhì)的代謝，從而降低患骨質(zhì)疏松癥的危險(xiǎn)，預(yù)防腎結(jié)石的形成；調(diào)節(jié)性激素效應(yīng)，從而減輕婦女更年期綜合征癥狀等[1-2]。但大豆分離蛋白分子質(zhì)量較大，分子結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜，食用后消化吸收慢，且含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[3]、致敏成分[4]等，影響其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及應(yīng)用。作為一種先進(jìn)的蛋白質(zhì)加工技術(shù)，“酶膜耦合”定向酶解，聯(lián)合復(fù)合菌種發(fā)酵技術(shù)可解決上述問題。該技術(shù)，可破壞原料蛋白過敏原的構(gòu)象表位和線性表位，降低過敏性風(fēng)險(xiǎn)，去除抗?fàn)I養(yǎng)因子，改善消化吸收特性。但針對(duì)此技術(shù)生產(chǎn)的發(fā)酵大豆蛋白肽粉營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功效性未見報(bào)告，故本研究開展發(fā)酵大豆蛋白肽粉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及功效性研究，以期為以后的應(yīng)用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

大豆分離蛋白，禹王；乳清蛋白(蛋白質(zhì)含量≥80%)，丹麥Arla；發(fā)酵大豆蛋白肽粉：以大豆分離蛋白為原料，先通過蛋白酶進(jìn)行部分酶解，然后使用類干酪乳桿菌、戊糖片球菌復(fù)合菌種發(fā)酵制得；野生型AB品系斑馬魚：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(浙)2012—0171，飼養(yǎng)管理符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證(認(rèn)證編號(hào)：001458)的要求。

1.1.2 試劑

胃蛋白酶和胰酶，Sigma；4%組織細(xì)胞固定液，Solarbio；二甲苯，上海麥克林生化科技有限公司；PBS緩沖液，武漢博士德生物工程有限公司；Mayer蘇木素染色液、伊紅染色液、中性樹脂封片劑，上海依赫生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CX31生物顯微鏡、SZX7解剖顯微鏡，日本OLYMPUS；VertAl CCD相機(jī)，上海土森視覺科技有限公司；CP214精密電子天平，美國(guó)OHAUS；6孔板、12孔板、96孔板，中國(guó)Nest Biotech；SPARK多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體外消化模擬試驗(yàn)

胃消化、腸道消化模擬實(shí)驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)[5]。

1.3.2 致敏性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

檢測(cè)方法及原理參考文獻(xiàn)[6-7]，詳細(xì)操作如下：隨機(jī)選取300尾4 dpf野生型AB品系斑馬魚于12孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均處理10尾斑馬魚。根據(jù)前期濃度摸索結(jié)果，發(fā)酵大豆蛋白肽粉對(duì)正常斑馬魚的無(wú)可見有害作用水平(no observed adverse effect level,NOAEL)為500 μg/mL，以NOAEL劑量1/9、1/3和1設(shè)定低劑量組、中劑量組和高劑量組，即發(fā)酵大豆蛋白肽粉質(zhì)量濃度為55.6、167、500 μg/mL，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組。每孔容量為1 mL，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置6個(gè)平行。各實(shí)驗(yàn)組與N-苯甲酰-DL-精氨酸對(duì)硝基苯酰胺鹽酸鹽(N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroaniline HCl, BAPNA)共同處理24 h后，將液體轉(zhuǎn)移至96孔板中，250 μL/孔，利用酶標(biāo)儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組類胰蛋白酶的相對(duì)吸光度值，以吸光度值(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)評(píng)價(jià)發(fā)酵大豆蛋白肽粉誘發(fā)類過敏的情況。

1.3.3 肌肉保護(hù)試驗(yàn)

檢測(cè)方法參考COFFEY等[8]研究,詳細(xì)操作如下：隨機(jī)選取120尾2 dpf野生型AB品系斑馬魚于6孔板中，每孔(實(shí)驗(yàn)組)均處理30尾斑馬魚。除正常對(duì)照組外，其余各實(shí)驗(yàn)組均給予1.5%無(wú)水乙醇、24 h，建立斑馬魚酒精性肌損傷模型。分別給予以下樣品：發(fā)酵大豆蛋白肽粉和乳清蛋白質(zhì)量濃度均為102.30 μg/mL，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每孔容量為3 mL。28 ℃處理24 h后，用4%組織細(xì)胞固定液固定，對(duì)斑馬魚進(jìn)行蘇木精-伊紅染色(固定-脫水-包埋-切片-染色)，并進(jìn)行病理學(xué)分析評(píng)價(jià)樣品肌肉保護(hù)功效。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 斑馬魚肌肉保護(hù)功效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria for muscle protection of zebrafish

2 結(jié)果與分析

2.1 營(yíng)養(yǎng)成分分析

由表2、表3可以看出，大豆分離蛋白粉通過部分酶解，蛋白質(zhì)的含量略有降低，但氨基酸構(gòu)成比例幾乎沒有變化，但發(fā)酵大豆蛋白肽粉形成整蛋白、多肽、低聚肽、氨基酸等多重氮源，可以實(shí)現(xiàn)梯度吸收，降低代謝負(fù)擔(dān)。通過發(fā)酵，碳水化合物含量略有增加，主要是因?yàn)橥ㄟ^發(fā)酵產(chǎn)生一定量有機(jī)酸等后生元成分。有機(jī)酸能夠提高胃酸分泌量，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。同時(shí)有機(jī)酸可以降低腸道內(nèi)pH值，具有重要的腸道調(diào)節(jié)功能。

表2 發(fā)酵大豆蛋白肽粉與大豆分離蛋白粉營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比分析Table 2 Nutritional components of fermented soybean protein peptide powder and soybean protein isolate powder

2.2 體外消化模擬試驗(yàn)

大豆分離蛋白粉通過部分酶解及復(fù)合菌種發(fā)酵之后胃消化率由原來(lái)的68.57%提高到81.61%，腸消化率由原來(lái)的76.35%提高到87.49%。發(fā)酵大豆蛋白肽粉可能是通過部分酶解形成蛋白質(zhì)和肽混合，通過發(fā)酵產(chǎn)生一些有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物，這些成分在水溶液中會(huì)通過分子間相互作用力，比如氫鍵、范德華力等相互結(jié)合，使得蛋白酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)被暴露，從而促進(jìn)蛋白的消化。

表3 發(fā)酵大豆蛋白肽粉與大豆分離蛋白粉氨基酸組成對(duì)比分析 單位：%

2.3 致敏性評(píng)價(jià)試驗(yàn)

類胰蛋白酶是肥大細(xì)胞內(nèi)預(yù)先合成的中性蛋白酶，是臨床上檢驗(yàn)人體是否過敏的重要指標(biāo)[9-10]。受肥大細(xì)胞活化劑BAPNA作用后，斑馬魚會(huì)產(chǎn)生過敏反應(yīng)，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞分泌類胰蛋白酶。類胰蛋白酶的OD值與類過敏反應(yīng)程度成正相關(guān)。斑馬魚致敏性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，發(fā)酵大豆蛋白肽粉55.6、167、500 μg/mL質(zhì)量濃度組OD值分別為0.116、0.085、0.094，與正常對(duì)照組相比具有極其顯著性差異，分別降低了43%、58%、53%，說(shuō)明發(fā)酵大豆蛋白肽粉在一定濃度范圍內(nèi)不會(huì)誘發(fā)類過敏反應(yīng)，降低致敏性風(fēng)險(xiǎn)同時(shí)可能存在抗敏性。

2.4 肌肉保護(hù)試驗(yàn)

由圖1可知正常對(duì)照組斑馬魚肌肉細(xì)胞呈均一長(zhǎng)條狀，且橫紋清晰，模型對(duì)照組肌纖維松弛，但未見浸潤(rùn)和壞死，乳清蛋白及發(fā)酵大豆蛋白肽粉處理組肌纖維紋理清晰、結(jié)構(gòu)緊密，與正常對(duì)照組較為相似，具有明顯的肌肉保護(hù)功效。

a-正常對(duì)照組；b-模型對(duì)照組； c-乳清蛋白組102.3 μg/mL；d-發(fā)酵大豆蛋白肽組102.3 μg/mL圖1 斑馬魚肌肉保護(hù)試驗(yàn)病理切片圖Fig.1 Pathological section of zebrafish muscle protection test

由表5可知，模型對(duì)照組相比于正常對(duì)照組具有極其顯著性差異，說(shuō)明造模成功。乳清蛋白組及發(fā)酵大豆蛋白肽組相對(duì)模型對(duì)照組具有極顯著性差異，說(shuō)明乳清蛋白和發(fā)酵大豆蛋白對(duì)斑馬魚都具有肌肉保護(hù)作用。乳清蛋白組相對(duì)發(fā)酵大豆蛋白肽粉組沒有顯著性差異，說(shuō)明發(fā)酵大豆蛋白肽粉對(duì)肌肉保護(hù)作用效果等同于乳清蛋白。

表5 肌肉保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果匯總表Table 5 Summary of muscle protection test results

3 結(jié)論

發(fā)酵大豆蛋白肽粉以大豆分離蛋白為原料，通過現(xiàn)代生物“酶膜耦合”定向酶解和復(fù)合菌種發(fā)酵技術(shù)精制而成，富含整蛋白、多肽、低聚肽、有機(jī)酸等活性成分。體外消化試驗(yàn)顯示發(fā)酵大豆蛋白肽粉相對(duì)大豆分離蛋白在胃、腸道消化率均有提高，李世成等[11]研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)補(bǔ)充大豆分離蛋白，補(bǔ)充大豆低聚肽具有更高的表觀消化率、儲(chǔ)存率和凈氮利用率，與本文結(jié)論相似。致敏性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示發(fā)酵大豆蛋白肽粉致敏性降低，在一定濃度下不會(huì)誘發(fā)致敏性反應(yīng)，具有抗過敏性作用，可能機(jī)理為大豆分離蛋白通過酶解和發(fā)酵破壞了原料蛋白過敏原的構(gòu)象表位和線性表位，弱化過敏信號(hào)通路，有效降低了致敏風(fēng)險(xiǎn)，與前人研究結(jié)果一致[12-13]。乳清蛋白富含支鏈氨基酸尤其是亮氨酸，且乳清蛋白屬于快膳食蛋白[14]，是被認(rèn)為抵抗肌肉衰減最有效的蛋白質(zhì)之一，對(duì)肌肉具有較強(qiáng)保護(hù)作用[15]，多個(gè)研究表明乳清蛋白在增肌，促進(jìn)肌肉合成方面優(yōu)于大豆蛋白[16-19]。但長(zhǎng)期補(bǔ)充乳清蛋白質(zhì)可能會(huì)對(duì)腸道微生物群產(chǎn)生負(fù)面影響[20]。本實(shí)驗(yàn)肌肉保護(hù)實(shí)驗(yàn)顯示發(fā)酵大豆蛋白肽粉具有肌肉保護(hù)作用，同時(shí)具有低致敏性，其在預(yù)防老年肌肉衰減產(chǎn)品及運(yùn)動(dòng)增肌產(chǎn)品應(yīng)用前景廣闊。