溫翠娟，周敏，張露丹，明瑤，呂曉華

（四川大學華西公共衛(wèi)生學院/華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041）

糙米是稻谷脫去穎殼后的穎果，由皮層、糊粉層、胚乳和胚組成，較好地保留了稻谷中絕大部分營養(yǎng)物質，其生理活性和營養(yǎng)價值遠高于精米[1]。但糙米因被高密度的粗纖維和糠蠟包裹，導致其口感粗糙、蒸煮性差；且糙米中的微量元素與植酸結合，難以被人體消化吸收[2]。糙米在發(fā)芽過程中，不僅保留原有成分，而且多種生物酶被激活，使蛋白質、維生素、γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）等成分含量升高[3]，與植酸結合的營養(yǎng)成分變?yōu)橛坞x態(tài)，米糠層纖維被軟化，從而提高了糙米的營養(yǎng)價值、適口性和消化吸收度。

GABA是一種存在于脊椎動物、植物和微生物中的氨基酸，也是人體神經系統(tǒng)重要的抑制性神經遞質，參與體內多種生理過程，如影響學習與記憶[4]、降血壓[4]、降血糖[5]、抗抑郁[6]、抗焦慮[7]、抗腫瘤[8]等，作為一種新型功能性因子，已廣泛應用于食品工業(yè)領域。植物組織中GABA的含量極低，植物在受到缺氧、熱激、冷激、機械損傷、鹽脅迫等脅迫應激時，GABA會迅速產生富集[9]。利用富含GABA的發(fā)芽糙米、大豆和蠶豆等原料開發(fā)功能食品已成為研究熱點。目前，采用浸泡發(fā)芽法生產發(fā)芽糙米時，糙米急劇吸水導致爆腰率增加[10]，水溶性GABA流失，影響其食用品質和營養(yǎng)價值；且用水量和污水排放量較大，不利于節(jié)能減排。本文采用循環(huán)灑水加濕法，探索糙米發(fā)芽的適宜條件，優(yōu)化糙米發(fā)芽工藝，以生產高γ-氨基丁酸發(fā)芽糙米，提高糙米的食用價值，為工業(yè)化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

糙米品種（Long Qin Dao 08-163）由四川省農業(yè)科學院農產品加工研究所提供，符合GB 2715—2016《食品安全國家標準糧食》的標準。

1.2 儀器與主要試劑

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配置 G1311B 四元梯度泵、G1329B自動進樣儀、G1316A柱溫箱、G13150紫外檢測器）：美國Agilent公司；A01型雙層發(fā)芽機：中山市容威電器有限公司。

GABA標準品（色譜純，純度>98%）：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：北京邁瑞達科技有限公司；乙酸鈉、氯化鈣、纖維素酶（酶活：5 000 U/g）、谷氨酸鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽糙米制備

人工篩選糙米，去除不完善粒、雜質等；去雜后用蒸餾水清洗糙米3遍，洗去表面的灰塵和糠粉，瀝干，經1%（質量分數(shù)）的次氯酸鈉溶液消毒10 min，再用超純水漂洗3遍。把經前處理的糙米平鋪于發(fā)芽機的置物盤上，將CaCl2、纖維素酶和谷氨酸鈉按計劃濃度配制成發(fā)芽液，每20 min灑水加濕一次（多余的發(fā)芽液從置物盤的孔徑中漏走），每12 h換一次發(fā)芽液，并置于計劃溫度下和計劃時間內發(fā)芽。發(fā)芽結束后，將發(fā)芽糙米漂洗后50℃烘干，粉碎后過60目篩，即得米樣。具體流程見圖1。

圖1 發(fā)芽糙米制備工藝流程Fig.1 Preparation process of germinated brown rice

1.3.2 單因素試驗

根據(jù)文獻設計發(fā)芽溫度、CaCl2濃度、纖維素酶濃度、谷氨酸鈉濃度和發(fā)芽時間，觀察不同發(fā)芽條件對發(fā)芽糙米GABA含量的影響。

1.3.2.1 溫度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

將發(fā)芽溫度分別設定為 25、30、35、40、45 ℃，糙米用清水發(fā)芽24 h，測定GABA含量。

1.3.2.2 CaCl2濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

在發(fā)芽溫度為40℃、發(fā)芽時間為24 h的情況下，將發(fā)芽液中的 CaCl2濃度分別設定為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL，對糙米進行發(fā)芽，測定GABA含量。

1.3.2.3 纖維素酶濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

在發(fā)芽溫度為40℃、發(fā)芽時間為24 h、發(fā)芽液中CaCl2濃度為1.5 mg/mL的條件下，將發(fā)芽液中的纖維素酶濃度分別設定為 0.32、0.64、0.96、1.28、1.60、1.92 mg/mL，對糙米進行發(fā)芽，測定GABA含量。

1.3.2.4 谷氨酸鈉濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

在發(fā)芽溫度為40℃、發(fā)芽時間為24 h、發(fā)芽液中CaCl2濃度為1.5 mg/mL、纖維素酶濃度為1.28 mg/mL的情況下，將發(fā)芽液中的谷氨酸鈉濃度分別設定為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol/L，對糙米進行發(fā)芽，測定 GABA含量。

1.3.2.5 時間對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

在發(fā)芽溫度為40℃，發(fā)芽液中CaCl2濃度為1.5 mg/mL、纖維素酶濃度為1.28 mg/mL和谷氨酸鈉濃度為1.2 mmol/L的情況下，將發(fā)芽時間分別設定為24、39、48、63、72、87 h，糙米進行發(fā)芽，測定 GABA 含量。

1.3.3 正交試驗

在糙米發(fā)芽條件單因素試驗的基礎上，以發(fā)芽溫度、CaCl2濃度、纖維素酶濃度、谷氨酸鈉濃度和發(fā)芽時間為變量，每個變量設定4個水平，進行五因素四水平正交試驗以確定最優(yōu)的制備工藝條件，正交試驗因素水平見表1。

表1 L16（45）正交試驗因素水平Table 1Factors and levels of L16（45）orthogonal test

1.3.4 γ-氨基丁酸的測定

1.3.4.1 標準曲線及樣品制備

準確稱取GABA標準品10.3 mg于25 mL容量瓶中以超純水溶解并定容，用超純水稀釋為梯度濃度的標準曲線工作液。將配制好的GABA標準曲線工作液進行HPLC分析，以濃度（μg/mL）為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y），得到標準曲線 y=8 961.6x-140.7（R2=0.999 9，n=6），線性關系良好。準確稱取發(fā)芽糙米樣品5.00 g，以 60%乙醇為提取液，液料比為 5∶1（mL/g），60℃超聲波輔助提取1 h后離心，上清液為GABA樣品溶液。

1.3.4.2 衍生條件及色譜條件

衍生化試劑為20 mg鄰苯二甲醛、1 mL甲醇、100 μL β-巰基乙醇、4 mL（pH 9.5）硼酸緩沖液，溶解即得。樣品衍生化：取樣品溶液300 μL、衍生化試劑150 μL、反應4.5 min后加入300 μL磷酸二氫鈉溶液（0.1 mol/L）終止反應，反應液以0.22 μm濾膜過濾后用于測定。

色譜條件：色譜柱為IORBAX Eclipse XDB-C18Analytica（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相 A 為乙酸鈉溶液（25 mmol/L），B 為乙腈；并以 0 min（A 與 B 體積比為 90∶10）至 15 min（A 與 B 體積比為 65∶35）洗脫梯度；流速為1.10 mL/min；紫外檢測波長為332 nm；柱溫為 40℃；進樣量為 10 μL。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。采用方差分析進行差異性檢驗。采用一般線性模型進行主效應分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)芽溫度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

發(fā)芽溫度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響見圖2。

圖2 發(fā)芽溫度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響Fig.2 Effect of germination temperature on GABA content in germinated brown rice

如圖2所示，隨著發(fā)芽溫度升高，GABA含量先升高后降低，在發(fā)芽溫度為40℃時達到最大值，發(fā)芽溫度為45℃時GABA含量降低。發(fā)芽糙米中GABA由谷氨酸經谷氨酸脫羧酶脫羧而成，谷氨酸脫羧酶的最適溫度是37℃～40℃[11]，此時谷氨酸脫羧酶等多種生物酶活性高，利于GABA的產生。但超過40℃時，生成的GABA在GABA轉移酶的催化下與丙酮酸或α-酮戊二酸發(fā)生可逆的轉氨反應，生成琥珀酸半醛和丙氨酸[9]，從而使GABA含量下降。故將最優(yōu)發(fā)芽溫度確定為40℃。

2.2 CaCl2濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

CaCl2濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響見圖3。

圖3 CaCl2濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響Fig.3 Effect of CaCl2concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖3所示，GABA含量隨著CaCl2的濃度增大先升高后降低，在CaCl2濃度為1.5 mg/mL時達到最大值，之后GABA含量隨CaCl2濃度增高而降低，故將CaCl2的最佳濃度設定為1.5 mg/mL。谷氨酸脫羧酶是一種鈣調素結合蛋白，Ca2+和谷氨酸脫羧酶結合可調節(jié)谷氨酸脫羧酶的活性，從而控制GABA的代謝[12]，適宜的Ca2+濃度利于GABA的產生。但發(fā)芽液中Ca2+濃度過高可使細胞內Ca2+濃度升高，此時細胞內Ca2+與磷酸反應形成沉淀，擾亂以磷酸為基礎的能量代謝，且對淀粉酶的活性產生抑制作用，從而抑制發(fā)芽和GABA 的形成[12-13]。

2.3 纖維素酶濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

纖維素酶濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響見圖4。

圖4 纖維素酶濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響Fig.4 Effect of cellulase concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖4所示，GABA含量隨纖維素酶濃度的增大先升高后降低再升高，在纖維素酶濃度為1.28 mg/mL時達到最大值。因此，將纖維素酶的最佳濃度確定為1.28 mg/mL。纖維素酶可使糙米皮層發(fā)生部分降解，有利于達到糙米發(fā)芽所需的含水率[14]，提高發(fā)芽效率，促進GABA的形成。此外，經纖維素酶處理的糙米，粗纖維被降解、皮層結構被破壞，使糙米的硬度下降，適口性更好[15]。

2.4 谷氨酸鈉濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

谷氨酸鈉濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響見圖5。

圖5 谷氨酸鈉濃度對發(fā)芽糙米GABA含量的影響Fig.5 Effect of sodium glutamate concentration on GABA content in germinated brown rice

如圖5所示，GABA含量在谷氨酸鈉濃度為1.2 mmol/L達到最大值。隨后GABA的生成量隨谷氨酸鈉濃度的升高而降低。谷氨酸是谷氨酸脫羧酶的唯一底物，谷氨酸鹽及其衍生物可轉化為谷氨酸，從而經脫羧生成GABA[16]。谷氨酸鈉溶解性較好[17]，且成本低廉，故將谷氨酸鈉的最佳濃度設定為1.2 mmol/L。

2.5 發(fā)芽時間對發(fā)芽糙米GABA含量的影響

發(fā)芽時間對發(fā)芽糙米GABA含量的影響見圖6。

圖6 發(fā)芽時間對發(fā)芽糙米GABA含量的影響Fig.6 Effect of germination time on GABA content in germinated brown rice

如圖6所示，發(fā)芽糙米中GABA的含量隨著時間的延長而增加。因為隨著發(fā)芽時間的延長，糙米內源性酶活性增強[18]，營養(yǎng)物質發(fā)生轉化，淀粉、蛋白質等大分子被分解為還原糖、游離氨基酸等[19]，利于GABA產生；但是發(fā)芽時間延長后，容易滋生微生物，使糙米產生刺鼻的氣味，感官品質下降，并且芽的長度較長，在礱谷時容易脫落[20]。因此，糙米發(fā)芽的最佳時間選為63 h，以兼顧GABA的累積和良好的感官品質。

2.6 正交試驗結果

正交試驗結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，5個因素對糙米富集GABA的主次效應為A>E>D>B>C，發(fā)芽溫度的影響最大，其次依次為發(fā)芽時間、谷氨酸鈉濃度、CaCl2濃度及纖維素酶濃度，糙米發(fā)芽富集GABA的最優(yōu)條件組合為A4B2C3D1E4，即正交試驗14號，發(fā)芽溫度40℃、CaCl2濃度1.0 mg/mL、纖維素酶濃度0.96 mg/mL、谷氨酸鈉濃度0.8 mmol/L、發(fā)芽時間63 h。在最優(yōu)條件組合下，糙米發(fā)芽后GABA含量為46.73 mg/100 g，同品種未發(fā)芽糙米GABA含量為9.44 mg/100 g，糙米發(fā)芽后GABA含量是發(fā)芽前的4.95倍。

對各因素水平下GABA含量進行方差分析見表3。

表3 正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance in orthogonal test

由表3可知，發(fā)芽溫度、CaCl2濃度、纖維素酶濃度、谷氨酸鈉濃度和發(fā)芽時間均對發(fā)芽糙米GABA含量影響顯著。

3 結論

本文利用循環(huán)加濕生產高γ-氨基丁酸發(fā)芽糙米的工藝最優(yōu)條件為發(fā)芽溫度40℃、CaCl2濃度1.0 mg/mL、纖維素酶濃度0.96 mg/mL、谷氨酸鈉濃度0.8 mmol/L、發(fā)芽時間63 h。此條件下發(fā)芽糙米GABA含量達發(fā)芽前的近5倍。故適宜條件下，循環(huán)加濕生產工藝可以大幅度提高發(fā)芽糙米的GABA含量。