田 雨，肖洪賀，陳吉聰，趙宇萌，李 賀，田晉明，楊靜嫻

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，β-淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)纖維纏結和神經(jīng)元凋亡是其最主要的病理改變[1]。研究表明[2]，AD 患者腦內存在的大量活性氧可導致患者腦內神經(jīng)細胞的脂質過氧化，進而誘導神經(jīng)元的凋亡，加速AD 進程。因此減少腦內神經(jīng)元的凋亡，改善腦內氧化應激水平是治療AD 的有效途徑。

B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphonda/leukemia 2，bcl-2）和bcl2-相關X蛋白（bcl2-associated X protein，Bax）是細胞凋亡信號轉導途徑中關鍵的一對調控基因。Caspase 3 是胱天蛋白酶凋亡亞型中的一種，具有剪切細胞蛋白的作用，可直接誘導細胞發(fā)生凋亡。其中，bcl-2、Bax 是線粒體膜通透性改變的重要調控因素，Bax 的過表達能促使細胞色素c的釋放，促進下游蛋白Caspase 3 蛋白的活化，從而誘導細胞凋亡[3]。

淫羊藿次苷Ⅱ（Icariside Ⅱ，ICS Ⅱ）是中藥淫羊藿的主要活性成分之一，相關研究表明，其具有抗炎、抗腫瘤和神經(jīng)保護等藥理作用[4]。另外，本課題組前期研究結果顯示[5]，以ICS Ⅱ為主要藥效成分的參棗健腦口服液能有效減少AD 小鼠腦內的神經(jīng)元凋亡并激活其內源性神經(jīng)再生?；谏鲜鲅芯拷Y果，我們推測ICS Ⅱ能通過改善腦內氧化應激水平，抑制神經(jīng)細胞凋亡來發(fā)揮抗AD 作用。因此，本實驗擬用H2O2誘導N2a 細胞構建體外細胞模型，采用免疫熒光化學、Western Blot 等方法探究ICS Ⅱ對H2O2-N2a 的保護作用及其潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑 淫羊藿次苷Ⅱ（113558-15-9，純度≥98%）購于四川省維克奇生物科技有限公司；胎牛血清（批號：19110505）購于浙江天杭生物科技股份有限公司；青-鏈雙抗（批號：J190007）購于美國Hyclone 公司；兔抗Caspase 3 蛋白抗體（WL02117）、兔抗Bax 蛋白抗體（WL01637）、兔抗bcl-2 蛋白抗體（WL03847）、兔抗GAPDH 蛋白抗體（WL01114）、HRP 標記山羊抗兔lgG（WLA023）和Hoechst 33258 染色液（WLA036a）均購于沈陽萬類生物技術有限公司；兔抗小鼠CyTM3 標記二抗（bs-0368R-Cy3）購于北京博奧森生物技術有限公司；CCK-8 細胞增殖檢測試劑盒（C0037）購自上海碧云天生物技術有限公司；LDH 乳酸脫氫酶試劑盒（A020-2-2）、SOD 超氧化物歧化酶測定試劑盒（A001-1-2）和MDA 丙二醛測定試劑盒（A033-1-2）購于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 實驗儀器 Ti-S 型熒光顯微鏡（日本尼康株式會社）；C00I01HW 型CO2培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；MR-96A 型酶標儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；Powerpac HC 型電泳儀、 Trans-Blot SD Cell 型半干式蛋白轉膜儀（Bio-Rad 公司）；SH-510 型凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.1.3 實驗細胞 小鼠神經(jīng)瘤母細胞（批號：210409G61）購于賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淫羊藿次苷Ⅱ的配制 精密稱取0.1 mg ICSⅡ，溶于194 μL DMSO 中，制成濃度為10 mmol/L 的ICS Ⅱ母液，加H-DMEM 稀釋至濃度為2.5 μmol/L的 ICS Ⅱ工作液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 H2O2-N2a 細胞模型的構建 將N2a 細胞以5 × 103cell/孔的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)30 h 后，分別加入濃度為62.5、125、250、500、1 000 μmol/L的H2O2損傷1.5 h[6]。隨后每孔加入10 μL CCK-8 溶液，37 ℃孵育1.5 h，檢測A450。重新鋪板30 h 后，以H2O2最佳的損傷濃度分別作用N2a 細胞1、2、3、4、5 h，并利用CCK-8 法檢測細胞存活率。

1.2.3 CCK-8 法檢測細胞存活率 取N2a 細胞以5 × 103cell/孔的密度接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的ICS Ⅱ（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 μmol/L）預保護24 h，隨后將培養(yǎng)基更換為H-DMEM 基礎培養(yǎng)基，模型組和給藥組給予500 μmol/L H2O2，2 h 后使用CCK-8 法檢測細胞存活率。

1.2.4 微板法檢測LDH 釋放量 取N2a 細胞以5 ×103cell/孔的密度接種于96 孔板中，待細胞貼壁后，給藥組給予0.25 μmol/L ICS Ⅱ預保護24 h，隨后將培養(yǎng)基更換為H-DMEM 基礎培養(yǎng)基，模型組和給藥組給予500 μmol/L H2O2，2 h 后收集上清液，并根據(jù)試劑盒使用說明檢測LDH 釋放量。

1.2.5 TBA 法檢測MDA 含量 取N2a 細胞以2 ×104cell/孔的密度接種于24 孔板中，待細胞貼壁后，給藥組給予0.25 μmol/L ICS Ⅱ預保護24 h，隨后將培養(yǎng)基更換為H-DMEM 基礎培養(yǎng)基，模型組和給藥組給予500 μmol/L H2O2。2 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加入500 μL1% TritonX-100 溶液破碎細胞30 min，反復凍融細胞3 次，隨后根據(jù)MDA 試劑盒使用說明進行檢測。

1.2.6 羥胺法檢測SOD 活性 細胞分組、鋪板、給藥、破碎等步驟同“1.2.5”，破碎細胞后按照SOD試劑盒說明書操作。

1.2.7 Hoechst 33258 染色檢測細胞凋亡 細胞分組、鋪板、給藥、造模等步驟同“1.2.4”。棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 4%多聚甲醛溶液固定細胞10 min。棄固定液，PBS 清洗5 min，重復兩次。加入100 μL Hoechst 33258染色液，并置于搖床上低速染色5 min。棄染色液，PBS 清洗5 min，滴加抗淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.2.8 免疫熒光化學法檢測細胞凋亡 細胞分組、鋪板、給藥、造模等步驟同“1.2.4”。棄培養(yǎng)基，PBS 清洗10 min。棄PBS，加入100 μL 4%多聚甲醛溶液固定細胞30 min。PBS 清洗5 min，洗2 次。棄PBS，加入100 μL 0.5% TritonX-100 溶液透化細胞15 min。棄透化液，加入50 μL 5% BSA 溶液封閉30 min。棄封閉液，PBS 清洗5 min。棄PBS，加入兔抗Caspase 3 一抗（1 ∶150 稀釋），4 ℃孵育過夜?；厥找豢梗覲BS 清洗10 min。棄PBS，加入50 μL CyTM3 標記二抗（1 ∶300 稀釋）室溫避光孵育1 h?；厥斩?，PBS 清洗10 min。棄PBS，加入50 μL細胞核染料DAPI 溶液染核2 min。棄去DAPI 溶液，滴加抗淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.2.9 Western Blot 法 檢 測bcl-2、Bax 和Caspase 3蛋白的表達情況 取N2a 細胞以1 × 106cell/mL 的密度接種于6 孔板中，細胞分組、給藥、造模等步驟同“1.2.4”。棄培養(yǎng)基，使用預冷的PBS 洗滌3 次，并根據(jù)全蛋白試劑盒說明書提取蛋白。使用BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。加入5 × Loading Buffer制備上樣緩沖液，隨后進行SDS-PAGE 凝膠電泳并轉膜。使用5%的脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入兔抗bcl-2、Bax、Caspase 3 和GAPDH 蛋白抗體，4 ℃孵化過夜；次日加入CyTM3 標記的山羊抗兔二抗孵育PVDF 膜。滴加超敏ECL 化學發(fā)光液，并置于凝膠成像儀中顯影。用Image J分析條帶并計算相對灰度值。

1.2.10 統(tǒng)計學方法用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 成功建立H2O2-N2a 細胞模型

實驗結果表明，N2a 細胞分別與62.5、125、250、500、1 000 μmol/L H2O2共孵育1.5 h 后，與對照組相比，各組細胞存活率均明顯下降且呈劑量依賴性（P＜ 0.01）；其中以500 μmol/L H2O2的損傷程度適中，故選擇此濃度進行后續(xù)實驗，見圖1。為了進一步確定H2O2損傷N2a 細胞的最佳時間，將N2a 細胞與500 μmol/L H2O2分別共孵育1、2、3、4、5 h，與500 μmol/L H2O2共孵育2、3、4、5 h 后，與對照組相比，N2a 細胞的存活率明顯下降且呈時間依賴性（P＜ 0.01），見圖2。且500 μmol/L H2O2損傷N2a細胞2 h 的細胞存活率基本維持在60%，損傷程度適中，故選擇500 μmol/L H2O2損傷N2a 細胞2 h 作為后續(xù)實驗的造模條件。

圖1 CCK-8 法檢測不同濃度H2O2 對N2a 細胞存活率的影響（n = 6）Fig. 1 The effect of different concentrations of H2O2 on the survival rate of N2a cells by CCK-8 assay（n = 6）

圖2 CCK-8 法檢測H2O2 作用不同時間對N2a 細胞存活率的影響 （n = 6）Fig. 2 The effect of different contact time of H2O2 on the survival rate of N2a cells by CCK-8 assay（n = 6）

2.2 ICS Ⅱ提升H2O2-N2a 的細胞存活率并改善形態(tài)

CCK-8 實驗結果見圖3，使用500 μmol/L H2O2損傷N2a 細胞2 h 后，與對照組比較，模型組細胞的存活率明顯下降（P＜ 0.01）；而經(jīng)不同濃度ICS Ⅱ預保護24 h 后，細胞存活率都有不同程度的提升，且與模型組之間的差異明顯（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。其中，以0.25 μmol/L ICS Ⅱ組細胞的存活率最高，故選擇0.25 μmol/L ICS Ⅱ預保護24 h 作為后續(xù)實驗的給藥濃度。對照組細胞胞體飽滿，細胞呈長梭形，而經(jīng)H2O2損傷后，模型組細胞胞體明顯皺縮；添加0.25 μmol/L ICS Ⅱ預保護24 h 后，細胞胞體皺縮情況明顯改善，部分細胞呈長梭形，見圖4。以上結果表明，ICS Ⅱ預保護能有效提升H2O2-N2a 的細胞存活率并改善形態(tài)。

圖3 CCK-8 法檢測ICS Ⅱ對H2O2-N2a 細胞存活率的影響（n = 6）Fig. 3 The effect of ICS Ⅱ on the survival rate of H2O2-induced N2a by CCK-8 assay（n = 6）

圖4 ICS Ⅱ對H2O2-N2a 細胞形態(tài)的影響Fig. 4 The effect of ICSⅡ on the morphology of N2a cells injured by H2O2

2.3 ICS Ⅱ減少H2O2-N2a 的氧化損傷

經(jīng)H2O2損傷后，與對照組比較模型組細胞LDH釋放量明顯增加（P＜ 0.01）；而經(jīng)ICS Ⅱ預保護24 h后，與模型組比較給藥組細胞LDH 釋放量明顯下降（P＜ 0.01）；提示ICS Ⅱ預保護能有效減少H2O2對于細胞的損傷，見圖5A。經(jīng)H2O2損傷后，模型組細胞內MDA 含量較對照組有明顯上升（P＜ 0.01）；而經(jīng)ICS Ⅱ預保護24 h 后，與模型組比較，給藥組細胞內MDA 含量明顯降低（P＜ 0.05），見圖5B。經(jīng)H2O2損傷后，與對照組比較模型組細胞內SOD 活性明顯下降（P＜ 0.01）；而經(jīng)ICS Ⅱ預保護24 h 后，與模型組比較，給藥組細胞內SOD 活性明顯上升（P＜ 0.01），見圖5C。以上結果證明，ICS Ⅱ能有效改善H2O2對N2a 細胞的氧化應激損傷。

圖5 ICS Ⅱ對H2O2-N2a 的LDH 釋放量和細胞內MDA、SOD水平的影響（n = 6）Fig. 5 The effects of ICS Ⅱ on the level of LDH, MDA and SOD in N2a cells injured by H2O2 （n = 6）

2.4 ICS Ⅱ減少H2O2-N2a 的凋亡

Hoechst 33258 染色結果見圖6、圖7，經(jīng)H2O2損傷后模型組細胞凋亡率明顯上升（P＜ 0.01）；而給予ICS Ⅱ預保護24 h 后，與模型組比較，給藥組細胞的凋亡率下降（P＜ 0.01）。使用免疫熒光化學法檢測各組細胞Caspase 3 蛋白的表達情況，見圖8、9。與對照組比較，經(jīng)H2O2損傷后模型組細胞Caspase 3 陽性細胞個數(shù)明顯上升（P＜ 0.01）；而經(jīng)ICS Ⅱ預保護后，與模型組相比，給藥組細胞Caspase 3 陽性細胞個數(shù)明顯下降（P＜0.01）。以上結果表明，ICS Ⅱ預保護能有效降低H2O2誘導的細胞凋亡。

圖6 Hoechst 33258 法檢測細胞凋亡Fig. 6 Cell apoptosis detected by Hoechst 33258 assay

圖7 Hoechst 33258 陽性細胞率統(tǒng)計圖（n = 3）Fig. 7 Statistical plot of Hoechst 33258 positive cells rate（n = 3）

圖8 免疫熒光染色法檢測Caspase 3 陽性細胞的表達Fig. 8 The expression of Caspase 3 positive cells detected by immunofluorescence staining

2.5 ICS Ⅱ下調H2O2-N2a 內Bax/bcl-2、Caspase 3蛋白的表達

圖9 Caspase 3 陽性細胞率統(tǒng)計圖（n = 3）Fig. 9 Statistical plot of Caspase 3 positive cells rate（n = 3）

為了進一步探討ICS Ⅱ抑制H2O2誘導的N2a 細胞凋亡的作用機制，利用Western Blot 實驗以GAPDH作為內參蛋白，檢測了bcl-2、Bax 和Caspase 3 的蛋白表達情況，見圖10、圖11。經(jīng)H2O2損傷后，與對照組比較，模型組細胞Bax、Caspase 3 蛋白表達量明顯升高，bcl-2 蛋白表達量明顯下降（P＜0.01）；而給予ICS Ⅱ預保護24 h 后，與模型組比較，給藥組細胞Bax、Caspase 3 蛋白表達量明顯下降，bcl-2 蛋白表達量明顯上升（P＜ 0.05，P＜ 0.01）。綜上所述，ICS Ⅱ能通過抑制Caspase 3/Bax/bcl-2 信號通路減少H2O2誘導的N2a 細胞凋亡。

圖10 Western Blot 條帶圖Fig. 10 Western Blot strip plot

圖11 Western blot 條帶定量統(tǒng)計圖（n = 3）Fig.11 Quantitative statistical plot of Western blot bands（n = 3）

3 討論

氧化應激引發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡是導致阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病的重要原因。相關研究表明[7-9]，H2O2能有效的誘導細胞氧化應激損傷，造成細胞凋亡，因此本實驗采用CCK-8 法摸索H2O2損傷N2a 細胞的最佳條件，結果顯示，與500 μmol/L H2O2共孵育2 h 是N2a 細胞造模的最佳條件。而高健美等[10]的研究表明，200 μmol/LH2O2作用24 h 是建立SH-SY5Y 細胞凋亡模型合適的條件；易鵬吉等[11]的研究結果顯示，500 μmol/LH2O2作用6 h 能建立PC12 細胞損傷模型。基于此，我們認為利用H2O2誘導不同種類的細胞需要不同的條件。

通常，機體內源性的自由基清除系統(tǒng)如SOD 等能夠清除氧化應激所產(chǎn)生的MDA，并且自由基的產(chǎn)生與清除處于一種動態(tài)平衡；而當細胞受到氧化應激損傷時，大量產(chǎn)生的自由基會打破這種平衡進而導致細胞凋亡。本研究結果表明，經(jīng)H2O2誘導之后的N2a 細胞MDA 含量顯著升高、SOD 活性明顯下降；而ICS Ⅱ預保護能明顯降低H2O2-N2a 細胞的氧化應激水平。這與ICS Ⅱ對過氧化損傷的SH-SY5Y 細胞的作用結果是一致的[10]，兩項研究結果共同證明了ICS Ⅱ具有良好的抗氧化作用。

越來越多的證據(jù)表明，氧化應激誘導神經(jīng)元凋亡會進一步加速AD 的認知障礙，因此減少氧化應激介導的神經(jīng)元凋亡具有重要意義。Hoechst 33258 染色和免疫熒光染色被用來檢測ICS Ⅱ對H2O2-N2a 細胞凋亡的影響，結果表明，ICS Ⅱ能有效降低Hoechst 33258、Caspase 3 陽性細胞數(shù)量。為了進一步闡述ICS Ⅱ減少H2O2導致N2a 細胞凋亡的潛在機制，Western Blot 法被用來檢測Caspase 3/Bax/bcl-2 信號通路上關鍵蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ能夠明顯減少H2O2損傷后N2a 細胞的Bax/bcl-2、Caspase 3蛋白表達量。因此，我們推測ICS Ⅱ可以通過能抑制Caspase 3/Bax/bcl-2 信號通路從而減少H2O2誘導的N2a 細胞的凋亡。

綜上所述，本研究以N2a 細胞為研究對象，利用H2O2構建AD 細胞模型，發(fā)現(xiàn)ICS Ⅱ降低H2O2-N2a 的氧化應激水平、減少細胞凋亡可能與抑制Caspase 3/Bax/bcl-2 信號通路有關。本研究闡釋了ICS Ⅱ減少H2O2誘導的細胞凋亡新機制，并豐富了其用于治療AD 的實驗基礎。

4 結論

本研究利用H2O2損傷N2a 細胞構建體外細胞模型，從抑制氧化損傷、減少神經(jīng)凋亡的角度出發(fā)，探究ICS Ⅱ對AD 神經(jīng)細胞的保護作用。實驗結果證明了ICS Ⅱ能通過改善氧化應激水平，抑制Caspase 3/Bax/bcl-2 信號通路減少H2O2-N2a 細胞的凋亡，這將為ICS Ⅱ用于治療AD 提供實驗基礎。此外，ICSⅡ能通過抑制Caspase 3/Bax/bcl-2 信號通路減少神經(jīng)細胞凋亡，而發(fā)揮抗AD 作用這一結論仍需通過動物模型進行進一步驗證。