張新悅，嚴(yán)德康，耿宏俠，王宇佳，李學(xué)濤

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）作為危害老年人健康的第四大“殺手”，對(duì)老年人健康和生活質(zhì)量造成巨大威脅[1]。中醫(yī)藥所提出的“補(bǔ)腎填髓”[2]理論，認(rèn)為“腎主骨生髓，腦為髓之?！?，通過(guò)滋養(yǎng)補(bǔ)腎可以起到改善腦部機(jī)能的作用。補(bǔ)腎藥淫羊藿具有補(bǔ)腎強(qiáng)筋、保護(hù)中樞神經(jīng)元的作用[3]；紅景天作為抗氧化藏藥[4]，可以有效抑制腦內(nèi)過(guò)氧化物的生成。兩藥聯(lián)用可協(xié)同增加藥效。

但淫羊藿苷在水中的溶解性差，生物利用度低[5]，絕大部分藥物不能進(jìn)入腦組織中；紅景天苷主要通過(guò)肝腎代謝，代謝速度快，腦中的含量更是微乎甚微[6]。脂質(zhì)體作為一種新型納米給藥載體[7]，可同時(shí)包載親水性和疏水性藥物，解決藥物溶解性差等問(wèn)題，但同時(shí)脂質(zhì)體的被動(dòng)靶向效率較低，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將腦靶向短肽Angiopep-2（TFFYGGSRGKRNNFKTEEY）[8]修飾在脂質(zhì)體表面，來(lái)增強(qiáng)腦部細(xì)胞對(duì)藥物的攝取。

本研究通過(guò)制備Angiopep-2 修飾的紅景天苷和淫羊藿苷脂質(zhì)體，采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選出最佳處方，并選用小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞[9]來(lái)考察Angiopep-2 的主動(dòng)靶向能力，為該制劑后續(xù)在體內(nèi)外進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

2010AHT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；DZKW-S-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；RE52C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；JY92-2D 型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；葡聚糖凝膠（Sepha-dex）G50柱（上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司）；YA1072 型透析袋MD34（8000 ～14000D）（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿苷（Ica，批號(hào)：J0703A，純度≥98%）、紅景天苷（Sal，批號(hào)：A0902AS，純度≥98%）、柔紅霉素（DNR，批號(hào)：28008-55-1，純度≥98%）、膽固醇（Chol，批號(hào)：F0119A）、pH7.4 磷酸緩沖鹽溶液（批號(hào)：1022Q021）均購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司；Angiopep-2（上海楚肽生物科技有限公司）；蛋黃卵磷脂（EPC，批號(hào)：120015）、DSPEPEG2000、DSPE-PEG2000-NH2均購(gòu)于日本NOF 公司；DMEM 培養(yǎng)基、青鏈霉素雙抗、胎牛血清、胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；甲醇、乙腈均為色譜純。

1.3 細(xì)胞

小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞（N2a）購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

2 方法與結(jié)果

2.1 脂質(zhì)體的制備

采用薄膜分散法-硫酸銨水化法制備。精密稱(chēng)取 適 量 的DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-NH2、蛋黃卵磷脂、膽固醇、淫羊藿苷、甲醇于圓底燒瓶中，減壓旋蒸，直至生成薄膜。加入濃度為250 mm硫酸銨水溶液5 mL 將薄膜溶解，于超聲波細(xì)胞搗碎機(jī)中處理10 min 后，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。再將脂質(zhì)體裝入透析袋中，放入盛有PBS 溶液的燒杯中避光透析24 h，每8 h 更換1 次PBS。24 h 后，稱(chēng)取適量紅景天苷置于圓底燒瓶中，加入甲醇旋蒸成膜，將透析好的脂質(zhì)體倒入裝有紅景天苷的圓底燒瓶中，于40℃水浴條件下振搖20 min，即得紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體。精密稱(chēng)取2 mg Angiopep-2，溶解于紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體中，室溫?cái)嚢? h,即得Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體。按上述制備方法，除不加入紅景天苷、淫羊藿苷外，同法制得空白脂質(zhì)體。

2.2 包封率測(cè)定方法的建立

2.2.1 溶液的制備 （1）空白溶液：取1 mL 空白脂質(zhì)體與4 mL 甲醇混勻，超聲破乳，即得。（2）供試品溶液：取1 mL Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體與4 mL 甲醇混勻，破乳即得。（3）紅景天苷對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)定紅景天苷10 mg，加甲醇制成1 mg/mL 母液，加適量甲醇稀釋成0.5 mg/mL紅景天苷對(duì)照品溶液。（4）淫羊藿苷對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)定淫羊藿苷 10 mg，加甲醇制成1 mg/mL 母液，加適量甲醇稀釋成0.4 mg/mL 淫羊藿苷對(duì)照品溶液。

2.2.2 紅景天苷的色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（20 ∶80，V/V）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.3 淫羊藿苷的色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（25 ∶75，V/V）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取“2.2.1”項(xiàng)下紅景天苷母液，加甲醇稀釋成720、600、480、360、180、90 μg/mL，淫羊藿苷母液稀釋成480、400、320、200、120、60 μg/mL，按相應(yīng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以藥物濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得紅景天苷回歸方程為Y= 2 122.2X+110 321（R2= 0.999 5），淫 羊 藿 苷 為Y=19 344X+288 198 （R2= 0.999 7），表明紅景天苷在90 ～ 720 μg/mL、淫羊藿苷在60 ～ 480 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下空白溶液、供試品溶液、紅景天苷對(duì)照品溶液、淫羊藿苷對(duì)照品溶液各適量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果待測(cè)成分峰與相鄰峰間的分離度均大于1.5，輔料對(duì)其無(wú)干擾，表明該方法專(zhuān)屬性好。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，測(cè)定6 次。結(jié)果，紅景天苷與淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.32%、0.24%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體，按“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液。結(jié)果紅景天苷與淫羊藿苷峰面積的RSD 分別為0.96%、0.94%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液，在 0、2、4、8、12、24 h 分別測(cè)定。結(jié)果紅景天苷與淫羊藿苷峰面積的RSD 分別為0.62%、1.17%（n＝6），表明溶液在24 h 之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 按“2.1”項(xiàng)下方法制備Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體，平行制備6 份，加入等體積甲醇，即得破乳液。將已知成分含量的破乳液與相應(yīng)對(duì)照品溶液按 1 ∶1（m/m）混勻，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算藥物含量。結(jié)果紅景天苷與淫羊藿苷的平均加樣回收率為102.5%、101.56%，RSD為1.7%、0.78%（n＝6），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 包封率的測(cè)定

取適量的Sephadex G50 凝膠柱用PBS 浸泡至溶脹后備用，將Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體1 mL 以1 mL/min 的流速進(jìn)行洗脫，目的是使未包裹進(jìn)去的水溶性藥物與脂質(zhì)體溶液分離，觀察直至流出溶液為乳光，開(kāi)始收集，加PBS 定容至5 mL，取等體積甲醇破乳后，另取Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體1 mL，PBS 定容即得，均過(guò)0.45 μm 微孔濾膜。

按照“2.2.2”和“2.2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紅景天苷和淫羊藿苷的含量，通過(guò)含量分別計(jì)算紅景天苷和淫羊藿苷的包封率：包封率（%）=Wa/Wb，Wa代表紅景天苷（或淫羊藿苷）過(guò)柱后的含量，Wb代表過(guò)柱前的含量。

2.4 處方優(yōu)化

采用Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)選出Angiopep-2修飾紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體的最佳處方。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室以往經(jīng)驗(yàn)[10]及文獻(xiàn)調(diào)研[11]，篩選出膽固醇用量（A）、紅景天苷用量（B）、超聲溫度（C）三個(gè)因素，考察其對(duì)包封率的影響。以包封率加權(quán)值（Y）為考察指標(biāo)，Y＝50% ×（Y1+Y2），其中，Y1表示紅景天苷的包封率，Y2表示淫羊藿苷的包封率。固定EPC 的用量為33 mg，處方量為5 mL，紅景天苷與淫羊藿苷的質(zhì)量比為1 ∶1 的條件下確定各因素的范圍區(qū)間（A：2 ～10 mg；B：0.5 ～1.5 mg；C：40 ～60℃），每因素平均篩選出三水平。因素與水平見(jiàn)表1，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 因素與水平Tab. 1 Factors and levels

根據(jù)表2 結(jié)果，通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件得到了Y的擬合方程：Y＝89.92 + 9.79A- 1.97B+ 0.49C+4.71AB+ 6.02AC- 6.66BC- 11.96A2- 7.27B2- 0.99C2（R2＝0.928 9，P＜0.05）。由此表明，該擬合模型可較好地反映響應(yīng)值Y的變化，可用于篩選Angiopep-2修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體的最佳處方。對(duì)模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3?？芍狝、AC、BC、A2、B2項(xiàng)對(duì)Y有顯著影響（P＜0.05），而B(niǎo)、C、AB、C2項(xiàng)影響不顯著（P＞0.05）。保持其中任一因素水平不變，即可看出其余因素對(duì)包封率的影響，見(jiàn)圖1。曲線越陡，對(duì)包封率影響越大，由圖1 可見(jiàn)，A、B兩因素對(duì)響應(yīng)值Y的影響較大，C對(duì)其影響較小。

圖1 各因素對(duì)包封率影響的等高線和響應(yīng)面圖Fig. 1 Contour and response surface graph of the effects of each factor on encapsulation efficiency

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab. 2 Design and results of Box-Behnken

表3 方差分析結(jié)果Tab. 3 Analysis results of variance

根據(jù)本課題組前期研究經(jīng)驗(yàn)及處方優(yōu)選結(jié)果，確定Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體的最佳處方為蛋黃卵磷脂33 mg，膽固醇6 mg，紅景天苷1.0 mg，淫羊藿苷1.0 mg，超聲溫度為60 ℃，超聲功率為500 W，處方量為5 mL，預(yù)測(cè)平均包封率為95.76%。按照該處方量制備3 批脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率，進(jìn)行處方驗(yàn)證，得到紅景天苷的包封率為（90.85 ± 1.83）%，淫羊藿苷的包封率為（92.59 ±1.20）%，表明該處方合理、方法可行。

2.5 對(duì)N2a 細(xì)胞主動(dòng)靶向性考察

2.5.1 熒光脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法-硫酸銨水化法制備。精密稱(chēng)取適量的DSPE-PEG2000、DSPE-PEG2000-NH2、蛋黃卵磷脂、膽固醇、甲醇于圓底燒瓶中，減壓旋蒸，直至生成薄膜。加入濃度為250 mM 的硫酸銨水溶液5 mL 將薄膜溶解，超聲處理10 min 后，裝入透析袋中避光透析24 h，每8 h更換1 次PBS。24 h 后，稱(chēng)取適量的熒光探針柔紅霉素置于圓底燒瓶中，加入甲醇旋蒸成膜，將透析好的脂質(zhì)體倒入裝有柔紅霉素的圓底燒瓶中，于40 ℃水浴條件下振搖20 min，即得柔紅霉素脂質(zhì)體（DNRLip）。精密稱(chēng)取2 mg Angiopep-2，溶解于柔紅霉素脂質(zhì)體中，室溫?cái)嚢? h,即得Angiopep-2 修飾的柔紅霉素脂質(zhì)體（Ang-DNR-Lip)。按上述制備方法，除不加入柔紅霉素外，即得空白脂質(zhì)體（Blank-Lip）。稱(chēng)取適量柔紅霉素溶解于水中，即得游離柔紅霉素溶液（Free DNR）。

2.5.2 細(xì)胞培養(yǎng) 使N2a 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)在培養(yǎng)瓶中，加入適量DMEM 培養(yǎng)液（10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗），置于培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）。待細(xì)胞融合度長(zhǎng)到95%以上時(shí)，胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液終止消化，離心，吸取上清液，加適量培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)傳代培養(yǎng)。

2.5.3 熒光顯微鏡考察脂質(zhì)體的主動(dòng)靶向性 由于紅景天苷和淫羊藿苷都不具有熒光性，所以選用具有熒光性的柔紅霉素作為熒光探針,給藥濃度為20 μm。將N2a 細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的數(shù)量接種到48孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)孵育使其貼壁。給藥時(shí)間為1、2、4 h，分別加入Blank-Lip、DNR-Lip、Ang-DNR-Lip及Free DNR，繼續(xù)孵育3 h 后，用PBS 緩沖液沖洗，每孔用500 μL 4%的多聚甲醛固定10 min，沖洗掉多余溶液，加入500 μL DAPI 染色液避光15 min，將細(xì)胞于熒光顯微鏡下觀察各孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，并拍照記錄。

空白脂質(zhì)體組未見(jiàn)紅色熒光。由于柔紅霉素會(huì)進(jìn)入到細(xì)胞核中，所以游離柔紅霉素的紅色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。使用Image J 軟件對(duì)圖片進(jìn)行熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)采用柱狀圖表示，見(jiàn)圖2。多組間比較采用方差分析，以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與DNR-Lip組相比，Ang-DNR-Lip 組熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜ 0.05），表明該脂質(zhì)體經(jīng)過(guò) Angiopep-2 修飾后，對(duì)N2a 細(xì)胞的主動(dòng)靶向性增強(qiáng)。通過(guò)對(duì)1、2、4 h 熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較，可知隨著攝取時(shí)間的增加，Ang-DNR-Lip 組的熒光強(qiáng)度依次增強(qiáng)。

圖2 熒光顯微鏡下觀察不同時(shí)間段不同脂質(zhì)體組對(duì)N2a 細(xì)胞的熒光強(qiáng)度 （n = 3）Fig. 2 Fluorescence intensity of different liposome groups on N2a cells at different time periods observed under fluorescence microscope（n = 3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要考察了膽固醇用量、紅景天苷用量、超聲溫度對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響。主要膜材成分膽固醇的加入可以使磷脂雙分子層的膜固化，但超過(guò)一定限度，會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)體成膜不牢固，藥物滲漏率增加。由于脂質(zhì)體獨(dú)特的雙分子層結(jié)構(gòu)，脂溶性藥物比水溶性藥物更容易包封，所以主要考察水溶性藥物紅景天苷的用量對(duì)包封率的影響，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)紅景天苷用量為1.0 mg 時(shí)，包封率較高；紅景天苷用量為1.5 mg時(shí)，反而下降，因?yàn)楫?dāng)水溶性藥物超過(guò)脂質(zhì)膜飽和限度時(shí)[13]，阻礙了藥物進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層中，所以并非藥物用量越高，包封率越好。超聲溫度在60 ℃時(shí)包封率較高，溫度過(guò)低會(huì)造成成膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且不均勻。

優(yōu)化后得到的Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體的最佳處方包封率較高，都在90%以上，結(jié)果符合2020 年版《中國(guó)藥典》規(guī)定[13]，說(shuō)明該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)科學(xué)合理。

在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)Angiopep-2 修飾后脂質(zhì)體組對(duì)N2a 細(xì)胞的攝取能力明顯高于脂質(zhì)體組，表明藥物成功與受體特異性識(shí)別和結(jié)合。Angiopep-2作為一種新型的腦靶向短肽，是以受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與血腦屏障上的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-1（LRP-1）特異性結(jié)合，將藥物以內(nèi)吞的方式，輸送至腦組織，提高了脂質(zhì)體的主動(dòng)靶向性。Angiopep-2通過(guò)與DSPE-PEG2000 交聯(lián)，不但可以使藥物精準(zhǔn)作用于病變部位，還延長(zhǎng)了藥物作用的時(shí)間，維持病變部位藥物濃度穩(wěn)定。肽鍵的不穩(wěn)定性也是影響Angiopep-2 靶向遞藥的關(guān)鍵，目前，對(duì)Angiopep-2的修飾通常以PEG 修飾，減小藥物在體內(nèi)的首過(guò)效應(yīng)，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，從而達(dá)到治療的效果。

4 結(jié)論

本研究制備了Angiopep-2 修飾的紅景天苷/淫羊藿苷脂質(zhì)體，并通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法確定了最優(yōu)處方，經(jīng)驗(yàn)證脂質(zhì)體包封率較高，改善了兩種藥物共載包封率較低的問(wèn)題。將靶向材料Angiopep-2修飾在脂質(zhì)體上明顯提高了腦部細(xì)胞對(duì)兩種藥物的攝取能力，改善了藥物不能有效達(dá)到病變區(qū)域的問(wèn)題，為后續(xù)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其它腦部疾病的治療與研究奠定了基礎(chǔ)。