張 寧，徐 劍,2,3*，徐 雪，劉 明,2,3，繆艷燕,2,3，張永萍,2,3，周雪嬌

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州省中藥民族藥炮制與制劑工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽(yáng) 550025）

提取方法是影響中藥臨床療效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1-2]。目前中藥提取方法有煎煮法、浸漬法、滲漉法、回流法、索氏提取法、水蒸氣蒸餾法等，傳統(tǒng)加熱方式在提取過(guò)程中存在效率低、能耗高等問(wèn)題[3]，建立綠色節(jié)能高效的提取方式是提高中藥制造業(yè)現(xiàn)代化水平的需求[4]。微波加熱是對(duì)物質(zhì)內(nèi)外同時(shí)整體進(jìn)行加熱，在提取效率上優(yōu)于傳統(tǒng)提取技術(shù)[5-7]。由于微波產(chǎn)生熱源的方式不同于傳統(tǒng)加熱方式，勢(shì)必影響中藥提取過(guò)程中成分的浸出，對(duì)藥效是否產(chǎn)生影響還有待驗(yàn)證。為了探討微波加熱對(duì)藥效的影響，本研究以丹參為模型藥，通過(guò)腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素建立大鼠急性心肌缺血模型，采用模糊綜合評(píng)判法對(duì)不同加熱模式丹參提取物的藥效進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為中藥微波提取物在臨床的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 大鼠50 只，雌雄各半，體質(zhì)量為200 ～ 250 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 藥物與試劑 丹參（貴州同濟(jì)堂中藥飲片有限公司，批號(hào)：C180612）；復(fù)方丹參片（廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，批號(hào)：L18A040）；鹽酸異丙腎上腺素注射液（上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：41181101，規(guī)格：2 mL ∶1 mg）；SOD 試劑盒（批號(hào)：20190614）、MDA 試劑盒（批號(hào)：20190612）、CK 試劑盒（批號(hào)：20190614）、LDH 試劑盒（批號(hào)：20190614）、總蛋白定量測(cè)試盒（批號(hào)：20190808）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要儀器 BL-420型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（四川成都泰盟科技有限公司）；SK8210 HP 型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；TGL-16B 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；OPWO8S 型澳潤(rùn)微波提取器（南京澳潤(rùn)微波科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 傳統(tǒng)加熱：稱(chēng)取丹參適量，用10 倍量95%乙醇加熱回流1.5 h，過(guò)濾；濾渣加10倍量50%乙醇回流1.5 h ，過(guò)濾；濾渣用10 倍量水回流2 h，過(guò)濾，合并三次濾液，減壓濃縮至干浸膏，并放置干燥器中保存。微波加熱基于課題組前期的研究，設(shè)置功率為600 W[8]。其它參數(shù)與傳統(tǒng)提取法一致。

1.2.2 分組、給藥及模型制備 取50 只大鼠分為正常組、模型組、陽(yáng)性藥物組（復(fù)方丹參片0.6 mg/g）、微波加熱組、傳統(tǒng)加熱組，共5 組，每組10 只。微波加熱組、傳統(tǒng)加熱組的給藥劑量以生藥量計(jì)算為5.4 mg/g，正常組、模型組大鼠灌胃給予等容積生理鹽水。大鼠急性心肌缺血模型的建立：大鼠連續(xù)給藥14 d，各給藥組從第12 天給藥30 min 后，除正常組外，其余各組均腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素（0.005 mg/g），每天1 次，連續(xù)3 d。

1.2.3 大鼠心電圖ST段的測(cè)定 第14天給藥30 min后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后將大鼠四肢皮下插入針灸針，連接肢導(dǎo)聯(lián)，記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，待心電圖穩(wěn)定后腹腔注射ISO（第三次），測(cè)定大鼠注射ISO 后5、15、30、60、180、300、600、900 s二導(dǎo)聯(lián)心電圖的ST 段[9]。

1.2.4 大鼠血流動(dòng)力學(xué)及心肌力學(xué)的測(cè)定 心電圖檢測(cè)后將大鼠頸部正中切開(kāi)皮膚，將事先充滿0.3%肝素鈉生理鹽水的留置針通過(guò)左側(cè)頸總動(dòng)脈，插到左心室，連接多道生理記錄儀，檢測(cè)是否插管成功[10]。成功后腹腔注射ISO（第三次）并記錄左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（± dp/dtmax）。

1.2.5 大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 的測(cè)定

在大鼠心電圖和血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后腹主動(dòng)脈取血，收集血液，于4℃靜置，離心（5 min，2 000 r/min），取血清分裝，置-80℃冰箱備用，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜ 0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.2.7 模糊綜合評(píng)判法 確定評(píng)價(jià)指標(biāo)、評(píng)語(yǔ)等級(jí)集和各指標(biāo)評(píng)價(jià)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)范圍，建立因素的權(quán)重集與評(píng)價(jià)因素之間的模糊關(guān)系，根據(jù)數(shù)學(xué)模型[11]，B =W*R 評(píng)判結(jié)果，建立評(píng)價(jià)因素的模糊關(guān)系矩陣。通過(guò)綜合評(píng)分Y = B*C，得到綜合評(píng)分結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)大鼠心電圖ST 段變化的影響

與正常組相比，模型組ST 段升高（P＜ 0.05），表明造模成功。與模型組比較，各給藥組均能降低ST 段變化（P＜ 0.05），各給藥組與陽(yáng)性藥物組相比、微波加熱組與傳統(tǒng)加熱組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明微波加熱沒(méi)有改變藥效，具體見(jiàn)表1。

表1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠ST 段的變化情況（mv，n = 10，±s）Tab. 1 Changes in ST segment of rats at different time points after modeling（mv，n = 10，±s）

表1 造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠ST 段的變化情況（mv，n = 10，±s）Tab. 1 Changes in ST segment of rats at different time points after modeling（mv，n = 10，±s）

注：同列字母完全不同，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜ 0.05，下表同。

組別 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 600 S 900 S正常組 0.04 ± 0.03a 0.02 ± 0.01a 0.03 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.09 ± 0.07a 0.05 ± 0.03a 0.06 ± 0.04a模型組 0.17 ± 0.05b 0.20 ± 0.05b 0.21 ± 0.03b 0.21 ± 0.04b 0.19 ± 0.05b 0.20 ± 0.05b 0.18 ± 0.03b 0.16 ± 0.04b陽(yáng)性藥物組 0.06 ± 0.07a 0.06 ± 0.08a 0.04 ± 0.04a 0.04 ± 0.03a 0.05 ± 0.05a 0.06 ± 0.03a 0.03 ± 0.02a 0.09 ± 0.07a微波加熱組 0.05 ± 0.03a 0.05 ± 0.03a 0.02 ± 0.02a 0.01 ± 0.01a 0.03 ± 0.05a 0.06 ± 0.05a 0.05 ± 0.03a 0.06 ± 0.07a傳統(tǒng)加熱組 0.03 ± 0.05a 0.04 ± 0.04a 0.06 ± 0.04a 0.02 ± 0.02a 0.04 ± 0.07a 0.03 ± 0.04a 0.04 ± 0.07a 0.02 ± 0.04a F 8.285 12.920 27.227 42.811 9.001 8.856 11.499 4.372 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.011

2.2 不同提取方式對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)的影響

模型組在注射ISO 后各時(shí)間點(diǎn)，與正常組相比-dp/dtmax 升高（P＜ 0.05），+dp/dtmax 降低（P＜0.05），表明大鼠在造模后心肌收縮、舒張功能受損。與模型組比較，各給藥組-dp/dtmax 降低（P＜ 0.05）、+dp/dtmax 升高（P＜ 0.05），各給藥組與陽(yáng)性藥物組相比、微波加熱組與傳統(tǒng)加熱組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05），說(shuō)明各給藥組均能改善心肌收縮、舒張功能，微波加熱并沒(méi)有改變藥效，具體見(jiàn)表2、3。

表2 造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 2 Changes in the maximum rate of increase of left ventricular pressure (+dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

表2 造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 2 Changes in the maximum rate of increase of left ventricular pressure (+dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

組別 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 900 S正常組 10 062.87 ± 2 487.67a 11 254.58 ± 2 041.36a 10 385.13 ± 1 662.76a 11 111.45 ± 1 707.96a 11 003.72 ± 1 380.70a 10 844.73 ± 983.49a 11 237.79 ± 1 362.43a模型組 7 052.25 ± 2 055.71b 6 837.46 ± 894.95b 7 443.18 ± 306.84b 6 790.77 ± 868.09b 6 784.36 ± 1 560.69b 7 564.29 ± 708.22b 7 832.34 ± 2 773.65b陽(yáng)性藥物組 10 513.00 ± 1 627.81a 10 170.59 ± 1 572.63a 10 405.58 ± 1 932.11a 10 766.60 ± 1 617.72a 11 223.75 ± 715.43a 10 835.98 ± 947.93a 11 800.23 ± 679.34a微波加熱組 9 786.68 ± 1 512.06a 10 082.09 ± 1 705.63a 10 760.19 ± 1 731.07a 10 805.97 ± 2 005.60a 11 029.97 ± 1 983.58a 11 011.35 ± 1 432.33a 11 058.35 ± 1 142.46a傳統(tǒng)加熱組 10 156.86 ± 1 259.81a 10 234.99 ± 1 466.10a 10 326.23 ± 1 188.26a 9 357.30 ± 1 907.93a 10 014.04 ± 1 752.43a 10 808.41 ± 1 616.26a 11 109.92 ± 1 907.52a F 3.306 4.505 3.383 4.628 5.863 7.220 3.353 P 0.039 0.014 0.037 0.012 0.005 0.002 0.038

表3 造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 3 Changes in the maximum drop rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

表3 造模后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dtmax)的變化情況（mmHg，n = 10，±s）Tab. 3 Changes in the maximum drop rate of left ventricular pressure (-dp/dtmax) in rats at different time points after modeling（mmHg，n = 10，±s）

組別 5 S 15 S 30 S 60 S 180 S 300 S 900 S正常組 -6 991.37 ± 1 713.24a -7 751.46 ± 1 737.09a -7 843.63 ± 1 923.77a -8 234.86 ± 1 161.48a -8 671.26 ± 969.51a -8 158.87 ± 619.92a -9 421.39 ± 1 676.20a模型組 -3 991.46 ± 1 119.39b -4 172.97 ± 545.89b -3 896.48 ± 478.60b -3 665.77 ± 840.41b -4 442.75 ± 891.17b -5 159.51 ± 430.16b -4 631.96 ± 1 505.10b陽(yáng)性藥物組-7 155.15 ± 2 353.54a -7 256.77 ± 2 341.13a -7 316.89 ± 2 442.70a -7 038.57 ± 2 692.42a -7 902.53 ± 2 393.37a -7 069.50 ± 2 206.22a -8 725.28 ± 2 334.10a微波加熱組-6 803.89 ± 447.18a -7 335.82 ± 638.83a -7 484.74 ± 660.83a -7 378.54 ± 1 043.99a -7 050.78 ± 1 596.22a -7 734.38 ± 796.43a -7 790.83 ± 1 391.86a傳統(tǒng)加熱組-7 399.60 ± 1 122.44a -7 588.50 ± 838.51a -6 871.03 ± 835.94a -6 307.37 ± 1 354.32a -7 264.71 ± 2 097.73a -7 335.51 ± 1 653.14a -7 678.83 ± 1 885.14a F 3.481 4.502 4.619 4.963 3.538 3.441 3.566 P 0.033 0.014 0.012 0.009 0.032 0.035 0.031

2.3 對(duì)大鼠血清LDH、CK、MDA、SOD 的影響

模型組血清中LDH、CK、MDA 含量高于正常組（P＜ 0.05），SOD 含量低于正常組（P＜ 0.05）。其它各給藥組LDH、CK、MDA 含量低于模型組（P＜ 0.05），SOD 的含量高于模型組（P＜ 0.05），各給藥組與陽(yáng)性藥物組相比、微波加熱組與傳統(tǒng)加熱組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。說(shuō)明各給藥組對(duì)心肌組織具有保護(hù)作用，微波加熱沒(méi)有改變藥效，具體見(jiàn)表4。

表4 丹參不同提取方法對(duì)大鼠血清中LDH、CK、SOD、MDA 的影響（n = 10，±s）Tab. 4 Effects of different extraction methods of Salvia miltiorrhiza on LDH, CK, SOD and MDA in rat serum（n = 10，±s）

表4 丹參不同提取方法對(duì)大鼠血清中LDH、CK、SOD、MDA 的影響（n = 10，±s）Tab. 4 Effects of different extraction methods of Salvia miltiorrhiza on LDH, CK, SOD and MDA in rat serum（n = 10，±s）

組別 劑量/ （mg/kg） LDH /（U/L） CK /（U/mL） SOD /（U/mL） MDA /（nmol/mL）正常組 - 3 118.59 ± 1 223.58a 9.76 ± 2.30a 252.10 ± 14.27a 3.12 ± 0.38a模型組 - 4 628.97 ± 726.01b 12.63 ± 2.81b 205.57 ± 38.89b 6.26 ± 1.67b陽(yáng)性藥物組 0.6 2 928.66 ± 809.53a 9.92 ± 2.13a 252.50 ± 19.88a 4.19 ± 0.30a微波加熱組 5.4 3 373.66 ± 1 330.80a 8.16 ± 1.57a 240.07 ± 29.72a 4.47 ± 0.82a傳統(tǒng)加熱組 5.4 3 657.12 ± 1 435.03a 8.80 ± 0.93a 229.66 ± 23.63a 4.68 ± 0.85a F 3.024 4.182 3.441 8.693 P 0.042 0.010 0.023 0.000

2.4 模糊綜合評(píng)判法結(jié)果

2.4.1 確定評(píng)價(jià)指標(biāo)U U = {u1, u2, …, u7} = {ST段、+ dp/dtmax,…,MDA}

2.4.2 確定評(píng)語(yǔ)等級(jí)集V V = {v1, v2, v3, v4} ={好、較好、一般、差}

2.4.3 確定各指標(biāo)評(píng)價(jià)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)范圍根據(jù)各指標(biāo)的均數(shù)、頻數(shù)分布確定等級(jí)范圍見(jiàn)表5。

表5 各指標(biāo)評(píng)價(jià)等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)范圍Tab. 5 The scope of the evaluation grade standard of each index

2.4.4 建立因素的權(quán)重集 采用上述的層次分析法所獲得的權(quán)重系數(shù)來(lái)建立因素的權(quán)重集。

2.4.5 建立評(píng)價(jià)因素的模糊關(guān)系 根據(jù)急性心肌缺血實(shí)驗(yàn)所獲得的各項(xiàng)指標(biāo)的實(shí)測(cè)值在其評(píng)價(jià)等級(jí)范圍內(nèi)的頻數(shù)分布建立模糊關(guān)系。

2.4.6 模糊綜合評(píng)價(jià) 根據(jù)數(shù)學(xué)模型，B=W*R 評(píng)判結(jié)果，其中，W 為各指標(biāo)權(quán)重組成的向量，R 為各指標(biāo)隸屬度向量組成的矩陣，B 為綜合評(píng)判的結(jié)果向量，按照最大隸屬度原則分別對(duì)不同加熱方式產(chǎn)生的藥效結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。根據(jù)各評(píng)價(jià)因素對(duì)藥效的影響程度，采用強(qiáng)制決定法[12]，確定各評(píng)價(jià)因素權(quán)重分別為ST 段（0.2）、+dp/dtmax（0.2）、-dp/dtmax（0.2）、急性心肌缺血（0.4）。因此，W={0.2、0.2、0.2、0.4}。

建立評(píng)價(jià)因素的模糊關(guān)系矩陣。

根據(jù)公式B = W*R 可得：

B微波= （0.317，0.525，0.117，0.050）

B傳統(tǒng)= （0.464，0.350，0.117，0.050）

為了更好的評(píng)價(jià)藥效，我們選擇各分?jǐn)?shù)區(qū)間的中值作為等級(jí)的參數(shù)，則參數(shù)項(xiàng)為CST段= {0.03，0.09，0.15，0.21}，C+dp/dtmax= {5 068.52，9 650.26，8 460.7，7 343.14}，C-dp/dtmax= {-3 991.25，-7 263.05，-5 824.14，-4 385.23}，CLDH= {2 523.5，3 332.5，4 141.5，4 950.5}，CCK= {7.7，9.9，12.11，14.32}，CSOD= {258，232，206，180}，CMDA= {4.395，5.405，6.415，7.425}。綜合評(píng)分Y = B*C，結(jié)果見(jiàn)表6。通過(guò)對(duì)7 個(gè)藥效指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，微波加熱藥效的綜合評(píng)分均大于傳統(tǒng)加熱藥效的綜合評(píng)分。

表 6 不同加熱方式丹參藥效的綜合評(píng)分Tab. 6 Comprehensive scores of Salvia miltiorrhiza with different heating methods

3 討論

據(jù)清代《本草逢源》記載，丹參具有“活血祛瘀，通經(jīng)止痛，清心除煩，涼血消癰”等功效[13]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用，因此本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射鹽酸異丙腎上腺素致大鼠急性心肌缺血，異丙腎上腺素可以興奮心臟，增強(qiáng)心肌功能，連續(xù)大劑量注射使心肌耗氧增加，大鼠由于心肌供氧不足引起心肌能量代謝障礙導(dǎo)致心電圖ST 段產(chǎn)生抬高或壓低的異常變化，導(dǎo)致左心室縮/舒功能異常，其中，左室內(nèi)壓最大上升/下降速率（±dp/dtmax）可以反映心肌收縮和舒張能力的變化情況。由于心肌組織處于缺血缺氧狀態(tài)，心肌細(xì)胞受損，LDH、CK 外漏，導(dǎo)致血液中LDH、CK 含量增加，氧自由基增加，導(dǎo)致消除自由基SOD 的減少，過(guò)氧化物MDA 的增多[14]。所以本實(shí)驗(yàn)通過(guò)大鼠心電圖ST 段變化，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、心肌酶等多指標(biāo)進(jìn)行考察，比較不同加熱模式下丹參提取物藥效的差異性。

結(jié)果表明，不同加熱模式下丹參提取物均能降低大鼠心電圖ST 段，能夠改善大鼠的收縮與舒張功能，具有清除氧自由基、抑制氧自由基的產(chǎn)生和過(guò)脂質(zhì)化的作用，抑制血清中CK、LDH 活性的升高從而保護(hù)心肌組織。將藥效數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后，各藥效指標(biāo)結(jié)果都表明不同加熱模式下丹參提取物能改善大鼠心肌缺血的癥狀，但是不同加熱模式之間藥效差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明微波加熱不會(huì)改變丹參原有的藥效。

進(jìn)一步通過(guò)模糊綜合評(píng)判法將藥效指標(biāo)的定性評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化為定量評(píng)價(jià)[15-16]，從7 種藥效評(píng)分表中可以直觀地看出微波加熱的藥效綜合評(píng)分大于傳統(tǒng)加熱的藥效評(píng)分，可見(jiàn)微波加熱的藥效強(qiáng)度大于傳統(tǒng)加熱的藥效強(qiáng)度。這與課題組前期研究[17]發(fā)現(xiàn)的微波提取的化學(xué)成分在種類(lèi)上沒(méi)有差異，但是丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮 Ⅱ A 的含量均大于傳統(tǒng)提取的含量的結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

本研究以大鼠急性心肌缺血為藥效模型來(lái)考察微波加熱對(duì)丹參提取物藥效的影響，結(jié)果表明微波加熱不會(huì)改變藥效，并且能夠在一定程度上增加藥效強(qiáng)度。由于本次實(shí)驗(yàn)采用的工藝參數(shù)為傳統(tǒng)加熱的最優(yōu)工藝參數(shù)，提取時(shí)間長(zhǎng)，傳統(tǒng)加熱與微波加熱的有效成分都提取完全，藥效強(qiáng)度差異較小。建議后續(xù)從提取動(dòng)力學(xué)角度研究，比較傳統(tǒng)加熱與微波加熱提取動(dòng)力學(xué)的差異性。本研究為微波提取技術(shù)在中藥大工業(yè)生產(chǎn)以及中藥微波提取物在臨床的廣泛應(yīng)用提供參考。