李斯斯 李鵬

【摘 要】文章簡(jiǎn)要綜述了國(guó)內(nèi)外亞硝酸鹽的檢測(cè)方法，根據(jù)《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》（GB 5009.33—2016）對(duì)紫外分光光度法測(cè)定乳粉中亞硝酸鹽含量進(jìn)行不確定度評(píng)定。通過建立數(shù)學(xué)模型，分析其測(cè)定過程，確定影響結(jié)果的不確定度因素，從而計(jì)算亞硝酸鹽含量的不確定度及擴(kuò)展不確定度。根據(jù)主要不確定度來源，尋找有效降低結(jié)果不確定度的途徑。

【關(guān)鍵詞】分光光度法;乳粉;不確定度;亞硝酸鹽;擴(kuò)展

【中圖分類號(hào)】O657.32 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2022）02-0046-04

0 引言

隨著綠色生態(tài)環(huán)保理念的普及及消費(fèi)者消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，綠色產(chǎn)品逐漸成為市場(chǎng)主流[1]。然而近年來食品質(zhì)量安全事件頻發(fā)，居民乳制品消費(fèi)信心受到重創(chuàng)[2]，乳制品質(zhì)量安全受到消費(fèi)者重點(diǎn)關(guān)注，尤其針對(duì)亞硝酸鹽等指標(biāo)，使得眾多研究者[3-4]對(duì)GB 5009.33—2016檢測(cè)方法進(jìn)行了改進(jìn)及探討。

亞硝酸鹽主要指亞硝酸鈉，其性狀為白色至淡黃色粉末或顆粒狀。因其具有較強(qiáng)氧化性，導(dǎo)致人體血液中低鐵血紅蛋白被氧化成高鐵血紅蛋白，失去攜氧功能，使人缺氧而發(fā)生中毒。亞硝酸鹽致癌機(jī)理可大致概括為胃酸條件下，亞硝酸鹽與某些物質(zhì)反應(yīng)生成強(qiáng)致癌物N-亞硝胺，甚至通過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，造成幼兒畸形。通常情況下，人體一次性攝入0.3 g以上的亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致急性中毒甚至死亡。因而，保障乳制品安全、降低風(fēng)險(xiǎn)是乳企義不容辭的責(zé)任。

本研究通過對(duì)亞硝酸鹽測(cè)定過程進(jìn)行分析，確定不確定度的主要來源，確保亞硝酸鹽結(jié)果的準(zhǔn)確性，以期為評(píng)定測(cè)量結(jié)果質(zhì)量提供有力的理論依據(jù)及指導(dǎo)。

1 食品中亞硝酸鹽的檢測(cè)方法

亞硝酸鹽指標(biāo)作為典型的污染物質(zhì)，國(guó)家監(jiān)督執(zhí)法部門加強(qiáng)對(duì)食品安全的抽查及監(jiān)管，其檢測(cè)方法成為國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的課題熱點(diǎn)，大致分為以下幾類。

1.1 光度法

光度法基本原理為利用溶液中亞硝酸鹽在一定波長(zhǎng)下具有選擇性吸收，其規(guī)律符合朗伯-比爾定律。其中，重氮偶合比色法（Griess法）最為典型，在弱酸條件下，亞硝酸鹽與芳香族胺重氮化，重氮鹽與電位偶聯(lián)劑生成有色的偶氮化合物。常用芳香族胺有硝基苯胺、磺胺酸、對(duì)氨基苯乙酮等，電位偶聯(lián)劑有苯酚、1—苯酚、1—氨基萘、1，3—二氨基苯等。

1.2 熒光法

熒光法是近幾年較新的檢測(cè)方法，其原理主要為亞硝酸鹽與非熒光類物質(zhì)發(fā)生重氮化或亞硝化后產(chǎn)生熒光化合物[5]。杜曉陽(yáng)[6]采用兩種方法制備了新型熒光探針NR-β-CD@AuNPs，研究發(fā)現(xiàn)該探針靈敏度高，在檢測(cè)水樣中的抗干擾性較強(qiáng)，加標(biāo)回收率為99.0%～102.0%。

1.3 色譜法

色譜法主要包括液相色譜法（紫外檢測(cè)器-液相色譜法）、離子色譜法（電導(dǎo)檢測(cè)器-離子色譜法、抑制電導(dǎo)檢測(cè)器-離子色譜法、紫外檢測(cè)器-離子色譜法）、氣相色譜法。李華麗[7]采用離子色譜法，對(duì)比電導(dǎo)檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器發(fā)現(xiàn)，采用紫外檢測(cè)器加標(biāo)回收率為91.7%～97.5%，準(zhǔn)確性更高。

1.4 電化學(xué)法[8]

亞硝酸鹽電化學(xué)傳感器的檢測(cè)原理為亞硝酸鹽被感應(yīng)元件中固定于電極表面的具有電活性和催化功能的修飾層催化，發(fā)生氧化反應(yīng)生成硝酸鹽，并將電極表面發(fā)生的反應(yīng)參數(shù)轉(zhuǎn)化成感應(yīng)信號(hào)，進(jìn)而測(cè)得電化學(xué)信號(hào)，經(jīng)電子系統(tǒng)處理后輸出并記錄。

1.5 快速檢測(cè)法

快速檢測(cè)法主要包括亞硝酸鹽檢測(cè)儀、亞硝酸鹽檢測(cè)管、亞硝酸鹽檢測(cè)試紙、亞硝酸鹽檢測(cè)試劑盒。陳敏[9]研制出一種以Whaterman的3 mm濾紙為材料的制作過程簡(jiǎn)單、保存時(shí)間久、檢測(cè)限低的亞硝酸鹽檢測(cè)試紙，選用對(duì)氨基苯磺酸溶液與鹽酸萘乙二胺溶液按質(zhì)量比2∶1作為顯色劑，加入20%酒石酸超聲溶解后浸泡3 min，40 ℃真空干燥1.5 h。

2 材料與方法[10]

2.1 試劑與設(shè)備

2.1.1 基本試劑

試樣為隨機(jī)購(gòu)買的乳粉。所用其他試劑（包括亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、冰乙酸、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等）均為分析純;水為《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和實(shí)驗(yàn)方法》（GB/T 6682—2008）規(guī)定的一級(jí)水。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)溶液

亞硝酸鈉（NaNO2）：純度99.90%，基準(zhǔn)試劑，天津市光復(fù)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（200 μg/mL，以亞硝酸鈉計(jì)）：稱取于110～120 ℃干燥至恒重的亞硝酸鈉基準(zhǔn)試劑0.100 0 g，加水溶解并移入500mL容量瓶中，定容搖勻，備用。亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液（5.0μg/mL）：臨用前，于100 mL容量瓶中吸入2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水定容至刻度，搖勻備用。

2.1.3 設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)（型號(hào)：TU-1901）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);電子分析天平（型號(hào)：AL207-IC）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司生產(chǎn)。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 原理

試樣經(jīng)提取沉淀后，在弱酸性條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化，后與鹽酸萘乙二胺偶合形成紫紅色染料，通過外標(biāo)法測(cè)出亞硝酸鹽的含量。

2.2.2 試樣預(yù)處理

將乳粉裝入足夠大的帶蓋容器中，反復(fù)搖晃和顛倒容器使試樣混勻。

2.2.3 試樣前處理

稱取試樣10 g置于150 mL具塞錐形瓶中，加入12.5 mL、50 g/L飽和硼砂溶液，加入約150 mL、70 ℃左右的水，混勻，于沸水浴中加熱15 min，冷卻并放至室溫。轉(zhuǎn)移上述試樣溶液于200 mL容量瓶中，依次加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液220 g/L乙酸鋅溶液各5 mL，搖勻。加水定容搖勻，放置30 min，過濾，棄初濾液30 mL，剩余濾液備用。

2.2.4 測(cè)定過程

于50 mL具塞比色管吸入40.0 mL濾液，另取9個(gè)50 mL具塞比色管，依次吸取0.00 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液。向以上比色管中各加4g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液2 mL，混勻，靜置3～5 min后，各加入2 g/L鹽酸萘乙二胺溶液1 mL，用水定容混勻，靜待15 min，在波長(zhǎng)538 nm處用1 cm石英比色皿，以零管調(diào)節(jié)零點(diǎn)，測(cè)量試樣吸光度，以亞硝酸鹽含量為橫坐標(biāo)，其吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

2.3 亞硝酸鹽含量的測(cè)量模型

公式（1）中，X為樣式中亞硝酸鹽的含量，mg/kg;V1為樣式處理液總體積，mL;V0為樣液總體積，mL;M為樣式的質(zhì)量，g;c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得測(cè)定用樣液中亞硝酸鈉的質(zhì)量，μg。

3 測(cè)量模型的構(gòu)建

3.1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

Y=K1×c-K0（2）

公式（2）中，Y為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液吸光值;c為亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)使用液的質(zhì)量，μg;K1為斜率;K0為截距。

3.2 不確定來源簡(jiǎn)析[11]

根據(jù)檢測(cè)流程分析，本試驗(yàn)方法不確定來源主要由5個(gè)部分組成：①制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的不確定度;②試樣測(cè)定時(shí)的不確定度;③試樣前處理過程引入的不確定度;④測(cè)定試樣重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度;⑤紫外可見分光光度計(jì)讀取吸光值引入的不確定度。

4 不確定度分量的確定與合成

4.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的不確定度

4.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

將不同質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度各測(cè)定3次，得到平均吸光度值分別為0.000，0.014 3，0.029 7，0.044 7， 0.061 3，0.077 7，0.113 0，0.148 3，0.190 0。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性最小二乘擬合，得線性方程Y=0.015 09c-0.000 06;相關(guān)系數(shù)R=0.999 1，斜率K1=0.015 09，截距K0=-0.000 06，屬B類不確定度。

對(duì)樣液進(jìn)行測(cè)定3次，樣液中亞硝酸鈉的平均質(zhì)量c0=2.676 7μg。

則擬合直線求樣液亞硝酸鈉質(zhì)量時(shí)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式如下：

公式（4）中，U1（c）為擬合曲線求樣液中亞硝酸鈉含量所產(chǎn)生的不確定度;s為通過貝塞爾公式求吸光度時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)偏差;P為試樣溶液測(cè)定次數(shù)，取值3;m為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)，取值3;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液系列個(gè)數(shù)，取值9;Yi'為標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值;K1為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，取值0.015 09;K0為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距，取值-0.000 06;ci為各標(biāo)液中亞硝酸鈉的質(zhì)量，單位為μg;c0試樣溶液中亞硝酸鈉的平均質(zhì)量，取值2.676 7μg;ci為各標(biāo)準(zhǔn)溶液中亞硝酸鹽的含量，取值5.003 0μg。

4.1.2 亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度

配制亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度主要來自基準(zhǔn)試劑的純度、稱量過程、定容體積和溫度，均屬于B類不確定度。

將以上分量合成，則計(jì)算亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U2=1.444 1×10-2，將標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度和標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度合成，即Urel（c）=4.772 0×10-2。

4.2 試樣測(cè)定時(shí)的不確定度

4.3 試樣前處理過程引入的不確定度

4.3.1 試樣稱量時(shí)的不確定度

試樣稱量為10 g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U1rel（m）=4.082 6×10-5。

4.3.2 試樣定容體積引入的不確定度（見表3）

試樣定容引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度U2rel（m）=6.791 6×10-4。

試樣稱量與試樣定容引入的相對(duì)不確定度Urel（m）=6.803 9×10-4。

4.4 測(cè)定試樣重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度

4.5 紫外可見分光光度計(jì)讀取吸光值引入的不確定度

5 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度

綜上所述，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：Uc（X）=4.889 9×10-2×1.34=0.065 mg/kg。

取置信水平區(qū)間95%，包含因子k=2，所以擴(kuò)展不確定度為U=Uc（X）×2=0.13 mg/kg。

6 測(cè)量不確定度的報(bào)告與表示[14]

乳粉中亞硝酸鹽含量為1.3 mg/kg，故其不確定度報(bào)告可表示為X=（1.3±0.1）mg/kg（k=2，置信區(qū)間95%）。

7 討論

通過不確定度來源及相對(duì)不確定度計(jì)算可知，亞硝酸鹽測(cè)定過程中，標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)結(jié)果產(chǎn)生較大影響。在平時(shí)檢測(cè)過程中，應(yīng)盡可能采用較高精度的玻璃儀器、純度高的試劑，增加標(biāo)準(zhǔn)工作液的測(cè)定次數(shù)和試樣的測(cè)定次數(shù)，并掌握檢測(cè)的關(guān)鍵點(diǎn)，規(guī)范操作，以降低結(jié)果的不確定度，保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

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