費冬梅, 黃朋, 李萌, 黃歡, 蘇家蓀, 歐陽魯平, 黃紅倩, 劉天盛, 李薇, 雷亞琴, 羅靜思△

廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院 1遺傳代謝中心實驗室、廣西出生缺陷預防控制研究所、廣西遺傳性疾病精準診治重點實驗室、廣西出生缺陷防治基礎研究重點實驗室, 2優(yōu)生遺傳門診，3超聲科(廣西南寧 530003)

胎兒腎臟多囊性病變(polycystic renal disease)是較常見的泌尿系畸形，種類較多[1]，包括嬰兒型多囊腎、多囊性發(fā)育不良腎、成人型多囊腎和梗阻性囊性發(fā)育不良腎等多種病變，產(chǎn)前表現(xiàn)各不相同，其病因及預后各不相同，部分是致命性的，必須盡早診斷，及時干預[2]。腎臟多囊性疾病是一組常見的腎臟囊性疾病，全球發(fā)病率為1∶500～1 000[3]。由于腎臟多囊性病變種類繁多，不能簡單地將該疾病歸為“多囊腎”，確切了解胎兒腎臟多囊性囊性病變類型對進一步產(chǎn)前咨詢意義重大[4]。我們通過對107例產(chǎn)前診斷中心胎兒腎臟多囊性病例的超聲表征、染色體核型和單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array，SNP-array)技術檢測結果及妊娠結局進行分析，探討SNP-array芯片技術檢測對腎臟多囊性病變胎兒產(chǎn)前診斷的臨床意義，為臨床咨詢提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年1月至2020年12月，于廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院遺傳門診就診的孕婦，行超聲篩查結果提示腎臟多囊性病變的病例，行介入性產(chǎn)前診斷，羊膜腔穿刺術或臍帶血穿刺取樣活檢術。同時行染色體核型分析及SNP-array檢測，本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會批準[桂婦保院醫(yī)倫快審(2022)第(1-3)號]，并與受試者簽署臨床研究知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 納入和排除標準 納入標準：定期于本院進行產(chǎn)前檢查；單活胎妊娠；產(chǎn)前超聲篩查提示胎兒腎臟多囊性病變者。排除標準：多胎妊娠；合并妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓等妊娠期合并癥者；臨床病歷資料不全者。

1.2.2 產(chǎn)前超聲檢測 使用GE Volusion 730型彩色多普勒超聲儀，經(jīng)腹掃查，凸陣探頭，頻率設置為3.5～5.5 Hz。在胎兒冠狀和矢狀切面掃查胎兒腎臟。腎臟測量方法及腎臟大小參考嚴英榴主編《產(chǎn)前超聲診斷學》的標準[5]。

1.2.3 介入性產(chǎn)前診斷方法及標本采集 本研究產(chǎn)前超聲篩查發(fā)現(xiàn)胎兒腎臟多囊性病變者，均建議行介入性產(chǎn)前診斷，包括傳統(tǒng)的染色體核型分析和SNP-array檢測。妊娠16～22孕周經(jīng)腹行羊膜腔穿刺術，抽取羊水30 mL，其中20 mL用于胎兒染色體核型分析，10 mL用于SNP-array檢測。妊娠22孕周后經(jīng)腹行臍靜脈穿刺術，抽取臍血3 mL，其中2 mL用于胎兒染色體核型分析，1 mL用于SNP-array檢測。

1.2.4 染色體核型分析 將采集的羊水或臍帶血細胞，按照實驗室SOP將細胞進行接種、觀察、收獲、制片及G顯帶后進行染色體核型分析。常規(guī)計數(shù)20個核型，分析5個核型，若發(fā)現(xiàn)異常核型時，則將計數(shù)與分析增加至50個核型。根據(jù)人類遺傳學國際命名體制(ISCN2016)，對染色體核型命名。

1.2.5 單核苷酸多態(tài)性微陣列檢測 采用QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取羊水、臍血樣本基因組DNA用于SNP-array檢測。提取DNA濃度>50 ng/L，A260/A280為1.8～2.0。采用illumina公司的HumanCytoSNP-12芯片進行SNP-array分析，根據(jù)標準操作流程對基因組DNA依次進行全基因組擴增、片段化、雜交和熒光染色，然后使用illumina公司的iScan芯片掃描儀對制備好的基因芯片進行掃描，獲得的數(shù)據(jù)通過KaryoStudio軟件進行分析。

1.2.6 SNP-array檢測的判斷和評價 數(shù)據(jù)分析參照廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心實驗室內部數(shù)據(jù)庫及國際常用的基因組與表型公共數(shù)據(jù)庫，包括正常人基因組變異數(shù)據(jù)庫(DGV)、DECIPHER、UCSC Genome Browser、在線人類孟德爾遺傳病的數(shù)據(jù)庫(OMIM)，以及PubMed文獻數(shù)據(jù)庫等公共在線數(shù)據(jù)庫?？截悢?shù)變異(copy number variation，CNV)分類判斷準，參照參考文獻[6]相關標準，其分類包括致病性CNV、疑似致病性CNV及臨床意義不明CNV。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。對胎兒染色體異常檢出率等計數(shù)資料，采用百分比(%)表示。兩種檢測方法比較采用2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 產(chǎn)前超聲檢測結果 本研究超聲異常的107例病例中，嬰兒型多囊腎36例，超聲影像表現(xiàn)為雙側腎臟對稱性增大伴腎實質回聲增強，腎皮質髓質界限無法區(qū)分。成人型多囊腎12例，超聲影像表現(xiàn)為腎實質回聲增強，均勻性增大，腎皮質髓質界限清楚，腎區(qū)內可見多個大小不等的囊性結構。多囊性腎發(fā)育不良59例，超聲影像表現(xiàn)為腎臟增大，腎區(qū)內可見多個大小不等、數(shù)量不一的囊腔，像一串葡萄粒，受累腎臟形態(tài)異常。本研究中未發(fā)現(xiàn)梗阻性囊性發(fā)育不良腎。

2.2 染色體核型分析結果 本研究超聲發(fā)現(xiàn)107例胎兒腎臟多囊性疾病病例，其中104例胎兒染色體核型正常，檢出染色體核型異常3例，3例異常分別為1例克氏綜合征，1例45，XN，der(14；21)(q10；q10)，1例46，XN，der(13)t(3；13)(q27；q34)。5例染色體多態(tài)性，分別為46，XN，inv(9)(p12q13)和46，XN，1qh+，異常檢出率2.8%(3/107)。

2.3 SNP-array檢測結果 107例羊水、臍帶血腎臟多囊性病變的胎兒樣本中，SNP-array檢出異常9例，異常檢出率8.4%(9/107)。芯片異常為致病性CNV 6例，可能性CNV 1例，臨床意義不明CNV 2例。將107例病例同時行染色體核型分析和SNP-array檢測。

2.4 檢出異常情況的統(tǒng)計學分析 SNP-array和染色體核型分析兩種方法相比，染色體核型異常檢出率為2.8%，SNP-array檢測異常檢出率為8.4%，兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(2=3.178，P=0.075)，核型正常者中的分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 9例胎兒腎臟多囊性病變的產(chǎn)前診斷結果及妊娠結局

3 討論

胎兒腎臟多囊性病變是產(chǎn)前超聲常見的泌尿系統(tǒng)異常疾病，大多研究僅報道了其超聲檢測中的關聯(lián)，但是很少有人關注SNP-array結果，因此，本研究將超聲篩查異常的腎臟多囊性病變進行SNP-array檢測。近年來，伴隨產(chǎn)前超聲技術的發(fā)展，胎兒腎臟異常檢出率不斷提高，腎臟畸形的類型不同，預后亦不同，嚴重者胎兒無法存活[7]。腎臟多囊性病變是最常見的先天性腎臟異常，其種類繁多，將胎兒腎臟多囊性病變分為四型[8]，即Potter Ⅰ型(嬰兒型多囊腎)、Potter Ⅱ型(多囊性發(fā)育不良腎)、Potter Ⅲ型(成人型多囊腎)、Potter Ⅳ型(梗阻性囊性發(fā)育不良腎)。各類型發(fā)病原因不同，臨床預后也不盡一致，遺傳方式也明顯不同。

對于產(chǎn)前超聲檢查提示為腎臟多囊性病變的胎兒，染色體核型分析技術是目前應用最廣泛的細胞遺傳學檢測方法[9]。染色體核型分析的檢出率較低，本研究97.2%染色體核型分析結果為陰性，由于本身有很大局限性。染色體核型分析是一種形態(tài)學檢測，完全靠肉眼識別，其分辨率低只能達到5 Mb的水平，不能精確判斷片段的來源、大小、性質及其所含的基因。研究中有6例染色體核型分析未見異常，而SNP-array提示微缺失或微重復，很大程度上彌補了染色體核型分析分辨率低的不足。染色體核型分析需要經(jīng)過細胞培養(yǎng)、制片、染色等復雜實驗操作，通常需要2～3周才能發(fā)放報告，并且染色體培養(yǎng)過程較為困難，人為因素較多，細胞培養(yǎng)失敗概率比較高[10]。而SNP-array技術只需3 d就可以完成實驗，無需細胞培養(yǎng)，通常1周就可以發(fā)放報告。SNP-array檢測的優(yōu)點還可分析沒有生命力的組織，例如流產(chǎn)絨毛、宮內死胎樣本等[11]。其檢測僅需少量胎兒組織提取DNA就能達到檢測目的，有助于排除致病性微缺失或微重復，從而避免患兒出生，降低出生缺陷率。

對于腎臟多囊性病變胎兒的遺傳咨詢和預后處理，需結合產(chǎn)前超聲監(jiān)測、染色體核型以及SNP-array技術等多方面綜合考慮。嬰兒型多囊腎可表現(xiàn)為嚴重的腎臟病變，胎兒預后不良，出生后多在新生兒期死亡。一般產(chǎn)前超聲診斷嬰兒型多囊腎臟，孕婦可選擇終止妊娠放棄胎兒。成人型多囊腎多數(shù)在成人期發(fā)病，約40歲表現(xiàn)有高血壓和腎功能衰竭癥狀，一般有家族史。多囊性發(fā)育不良大多數(shù)為單側腎臟發(fā)病，對側腎臟多為發(fā)育正常，預后良好；若為雙側病變，通常胎兒預后不良[12]。本研究中尚未發(fā)現(xiàn)梗阻性囊性發(fā)育不良腎。

Cai等[13]報道的147例先天性腎臟和泌尿系統(tǒng)異常中，SNP檢測出CNV異常13例(8.8%)：在異常CNV組中，多囊腎發(fā)育不良的胎兒中CNV的頻率最高(13.5%)，SNP-array技術的發(fā)展極大地提高了常規(guī)染色體核型無法被診斷的遺傳病診斷率。一些研究報道，在先天性結構畸形和神經(jīng)認知發(fā)育障礙中，可用于診斷另外12%～15%的遺傳病。易鳳梅等[14]報道了20例多囊性發(fā)育不良腎，染色體核型均為正常，CMA檢測結果單純多囊性發(fā)育不良腎者4例異常，合并其他結構異常者有3例異常，而本研究異常比例為8.4%。可能原因是由于選擇病例存在偏倚。Staebler等[15]對73例多囊性發(fā)育不良腎的胎兒進行核型分析，僅發(fā)現(xiàn)2例(2.7%)胎兒染色體核型異常。在本研究中，我們對107例產(chǎn)前超聲顯示腎臟多囊性病變的胎兒伴或不伴其他腎外異常的胎兒進行核型分析，結果顯示3例胎兒核型結果異常，檢出率為2.8%(3/107)，與Staebler等的文獻報道基本一致。在臨床工作中，常常會遇到染色體正常，但是超聲檢測或其他方法檢測提示胎兒發(fā)育異常的情況，急需用其他方法來進行遺傳學檢測，以盡早判斷胎兒的情況。SNP-array技術是近年來發(fā)展的一項分子檢測技術，越來越多地應用到臨床遺傳學的產(chǎn)前診斷。該技術可通過一次實驗同時檢測微陣列芯片上高達幾十萬甚至上百萬的DNA片段，可以檢測到5～20 kb基因組片段的缺失與擴增。能夠覆蓋全基因組DNA，具有高通量、高分辨率、檢測速度快等特點。該技術不但能檢測基因組內微缺失/微重復(<5 Mb)，還可檢測嵌合體(嵌合比例>20%)、雜合性缺失(loss ofheterozygosity，LOH)以及單親二倍體(uniparental disomy，UPD)等[16]。該技術在超聲篩查提示異常的胎兒中應用越來越多，從而提高了異常胎兒中檢測染色體微缺失和微重復綜合征的水平。但SNP-array技術無法檢測出染色體平衡易位、倒位。本研究通過兩種方法聯(lián)合應用，共計107例樣本中，SNP-array檢出9例異常，異常檢出率為8.4%(9/107)，核型的檢出率僅是2.8%(3/107)。與染色體核型對比，大大提高了遺傳性疾病的診斷率，降低其漏診率。染色體核型異常檢出率與SNP-array異常檢出率比較，SNP-array技術檢出率高于染色體核型分析技術檢出率。

本研究SNP-array技術共檢出6例致病性CNV病例(其中1例非整倍體異常)，1例可能致病性CNV病例和2例臨床意義不明的CNV病例。本研究中病例2染色體核型分析結果為羅伯遜易位，SNP-array檢測結果為21q21.1q22.3區(qū)域存在27.5 Mb的純合區(qū)(AOH)，提示該染色體可能存在單親二倍體(UPD)。未能檢測出染色體平衡易位，SNP-array檢測技術正成為新的染色體檢測手段，但也有其局限性，不能檢測染色體倒位和染色體平衡易位、點突變、基因組低比例嵌合、四倍體等。病例4染色體核型分析結果為46，XN，der(13)t(3，13)(q27，q34)，核型分析結果為染色體不平衡易位，SNP-array檢測顯示3q27.3q29區(qū)域存在約11.10 Mb片段重復，13q34區(qū)域存在約2.04 Mb片段缺失，可見SNP-array能檢測不平衡易位，因此結果與核型分析結果一致。從SNP-array檢測結果我們不知道該缺失區(qū)域和重復區(qū)域是如何重排的，對于不平衡易位基因組只能標識基因組不平衡的區(qū)域，不能提供產(chǎn)生該變異或重排的相關機制。由此可見，將兩者結合起來分析是有必要的。

病例8為檢測到樣本20p12.2區(qū)域存在約0.5 Mb片段缺失，為致病性拷貝數(shù)變異。20號染色體該片段缺失包含已知OMIM致病基因JAG1，該基因為單倍劑量敏感型基因，該基因的缺失與Alagille綜合征相關；Alagille綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，主要表現(xiàn)為5種臨床上的異常：膽汁淤積癥、心臟病、骨骼異常、眼部異常以及特征性的面部表型；約39%的患者存在腎臟受累，主要是腎發(fā)育不良；該基因的突變可為新發(fā)變異也可遺傳自受影響程度不同的雙親[17]。

17q12缺失綜合征，該片段缺失包含關鍵基因HNF1B及LHX1，患者臨床表現(xiàn)廣泛，主要癥狀包括多囊腎，腎發(fā)育不良等腎臟方面的異常，以及青年期糖尿病，部分患者還可表現(xiàn)為多種神經(jīng)發(fā)育異常，如智力低下和自閉癥，語言發(fā)育遲緩等[18-19]。也有報道與婦女生殖系統(tǒng)苗勒管發(fā)育畸形有關[20]。Zhou等[21-22]報道了17q12微缺失病例，也充分闡述了17q12缺失與腎臟多囊性疾病的高度相關性，17q12缺失綜合征是導致腎臟異常，成熟型糖尿病的年輕人和神經(jīng)發(fā)育障礙的原因。Nagamani等[23]也報道了4例17q12微缺失患者的臨床表現(xiàn)，其中2例表現(xiàn)為仍有保留腎功能的腎囊腫，1例為完全無功能的右腎多囊性發(fā)育不良，還有1例為腎發(fā)育不良并腎功能衰竭并行腎臟移植。本研究中僅檢出1例，因超聲檢查發(fā)現(xiàn)“胎兒右腎多囊性發(fā)育不良”抽羊水行產(chǎn)前診斷，胎兒染色體核型正常，SNP-array檢測arr[GRCh37]17q12(34815551-36353746)×1，約1.5 Mb片段缺失，17q12缺失的大小可為1.06～2.46 Mb。由此可見HNF1B基因缺失與胎兒多囊腎、腎臟發(fā)育不良密切相關，對指導下一胎妊娠具有非常重要的作用。研究中病例3、病例6和病例9未見有文獻報道與腎臟多囊性病變有關，該16p13.11片段重復、12p13.33p11.1片段重復和1q21.1q21.2微缺失綜合征是否會引起腎臟多囊性病變仍需進一步研究。

SNP-array檢測最大的優(yōu)勢是具有較高的分辨率，檢測臨床上的一些重要結構異常具有較高的敏感性，尤其是在常見遺傳綜合征的檢測上敏感性較高，這在產(chǎn)前診斷臨床應用中已經(jīng)得到印證。但該技術也有其局限性，不能檢測平衡性的改變，如染色體平衡易位、倒位及復雜性重排。盡管基因芯片已取得了長足的發(fā)展，但許多技術問題仍有待完善，相信隨著技術的不斷提高，基因芯片在產(chǎn)前診斷上將發(fā)揮更加重要作用。SNP-array技術的不足之處，目前仍然無法對點突變致病的患者作出準確的檢測。Dong等[24]對12個多囊腎病家庭進行檢查和分析，12個家系中有9個被鑒定為致病變異，并在家族中引起常染色體顯性多囊腎病，對先證者進行全外顯子組測序(WES)或全基因組測序(WGS)以檢測致病基因。本研究的后續(xù)工作將考慮應用全外顯組測序或全基因組測序對染色體核型分析和SNP-array檢測正常的胎兒樣本進行基因突變檢測。本研究中兩種方法的比較差異無統(tǒng)計學意義，導致無統(tǒng)計學意義的原因可能由于入選樣本量較小，沒有足夠的檢驗效能以至于出現(xiàn)假陰性的結果，因此需要擴大樣本量，以得到更加全面可靠的評估。

綜上所述，產(chǎn)前超聲篩查雖然有一定的局限性，但是對篩查腎臟多囊性病變有重要的臨床應用價值。如果能將SNP-array技術引入產(chǎn)前診斷，由于該技術具有高通量、高分辨率、檢測速度快等特點，那么就可以盡早發(fā)現(xiàn)和診斷胎兒異常，減輕對孕婦的身體和心理傷害。對于有致病性報道的嚴重畸形胎兒，及時終止妊娠，可以降低出生缺陷率，提高出生人口素質，可以減輕家庭經(jīng)濟負擔和精神壓力。胎兒腎臟多囊性病變種類繁多，更需要我們做好超聲檢查及產(chǎn)前診斷，常規(guī)染色體核型分析聯(lián)合SNP-array技術同時檢測，兩者可互相彌補，兩種技術結合可提高檢出率并能獲得更多的遺傳信息，可為胎兒產(chǎn)前診斷、遺傳咨詢及預后評估提供強有力的診斷依據(jù)。

利益相關聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：實驗設計、數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及論文撰寫由費冬梅完成；基因芯片結果分析由黃朋和蘇家蓀完成；臨床信息采集和隨訪妊娠結局由李萌完成；產(chǎn)前超聲檢測由黃歡完成；染色體細胞培養(yǎng)由歐陽魯平和黃紅倩完成；染色體核型分析由劉天盛和雷亞琴完成；基因芯片DNA提取由李薇完成；實驗評估由羅靜思完成。