馮姍姍, 索艷, 王肅

天津市第五中心醫(yī)院內分泌科(天津 300450)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是臨床上較常見的一種除酒精因素之外的其他生物因素所造成的肝代謝性疾病，也是世界范圍內肝臟疾病的最重要原因之一[1-3]。糖尿病是一種常見的慢性終身性疾病，2型糖尿病是糖尿病最常見、發(fā)病率最高的一種類型，且大多數(shù)2型糖尿病患者常伴有嚴重的慢性并發(fā)癥[4-5]。近年來隨著人們飲食習慣的改變，2型糖尿病合并NAFLD的發(fā)病逐漸增多，嚴重影響患者的健康及生活質量。長鏈非編碼RNA H19(long non-coding RNA H19，LncRNA H19)是一個逆轉錄本長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，可在轉錄后控制基因的表達[6]。有研究表明，LncRNA H19在不同疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。胰島素抵抗是2型糖尿病的重要發(fā)病機制，也是NAFLD的病理基礎[7]。目前，LncRNA H19與2型糖尿病合并NAFLD的發(fā)病機制及其胰島素抵抗的關系尚不清楚。基于此，本研究擬通過檢測2型糖尿病合并NAFLD患者血清LncRNA H19的表達情況，探究其表達水平與2型糖尿病合并NAFLD患者胰島素抵抗的關系，以期為臨床診斷及治療2型糖尿病合并NAFLD提供有價值的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年4月至2020年8月，在本院門診確診并住院的2型糖尿病患者229例，根據(jù)患者的腹部超聲檢查結果，將其分為2型糖尿病合并NAFLD組和2型糖尿病組。2型糖尿病合并NAFLD組109例，其中男63例，女46例。2型糖尿病組120例，其中男51例，女69例。2型糖尿病合并NAFLD組及2型糖尿病組之間性別、年齡及病程比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組基本資料比較

2型糖尿病組納入標準：(1)符合世界衛(wèi)生組織1999年制定的2型糖尿病相關診斷標準[8]；(2)患者及家屬選擇在本院接受治療者；(3)臨床資料齊全者。2型糖尿病合并NAFLD組納入標準：(1)符合2010版《非酒精性脂肪性肝病診療指南》中制定的NAFLD診斷標準的[9]，并同時患有2型糖尿病者；(2)患者及家屬選擇在本院接受治療者；(3)臨床資料齊全者。排除標準：(1)同時患有甲狀腺等其他內分泌疾病者；(2)同時患有慢性腎功能不全者；(3)其他類型糖尿病或患有嚴重自身性免疫疾病者；(4)臨床資料不全者。

本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準通過(WZX-EC-KY2021036)，所有樣品采集均取得患者及家屬知情同意并簽字，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑與儀器 全自動生化分析儀(型號：BS-200)，購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；RNA提取試劑盒(貨號：ml284600)，購自上海酶聯(lián)生物公司；逆轉錄試劑盒(貨號：AORT-0020)，購自上海伯易生物科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(貨號：V115896)，購自美國Applied Biosystems公司；LncRNA H19及內參GAPDH引物，由上海生工生物公司合成；本研究中其他大部分化學藥品均購自上海銳塞生物技術有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 于清晨抽取所有研究者空腹狀況下的靜脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min后收集上層血清，置于-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 生化指標檢測 取出待測血清，在本院檢驗科用全自動生化分析儀測定高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein C，LDL-C)、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)；用化學發(fā)光免疫分析儀采用化學發(fā)光法測定空腹血胰島素(fasting blood insulin，F(xiàn)INS)；采用高效液相色譜法測定糖化血紅蛋白A1C(hemoglobin A1c，HbA1C)；利用穩(wěn)態(tài)模式評估法計算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR)，對胰島素抵抗進行評估：HOMA-IR=(FPG×FINS)/22.5。

1.3.3 實時熒光定量PCR法(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測血清LncRNA H19水平[10]取待測血清，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)逆轉錄得到cDNA。以逆轉錄合成的cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測。PCR反應體系共10 μL，上下游引物各0.2 μL。PCR反應條件為：95℃，2 min；95℃，25 s；60℃，30 s；72℃，20 s，共40個循環(huán)。血清LncRNA H19及內參GAPDH的上下游引物序列見表2。采用2-ΔΔCT法計算血清LncRNA H19相對表達量。

表2 引物序列

2 結果

2.1 一般資料比較 2型糖尿病合并NAFLD組的TG、LDL-C、TC水平顯著高于2型糖尿病組(P<0.05)，而兩組患者的體質指數(shù)、HDL-C比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 兩組LncRNA H19表達水平 2型糖尿病合并NAFLD組血清LncRNA H19表達水平顯著高于2型糖尿病組(t=22.817，P=0.000)。見圖1。

注：A:2型糖尿病合并NAFLD組；B:2型糖尿病組

2.3 兩組血糖相關指標比較 2型糖尿病合并NAFLD組FPG、HOMA-IR、HbA1C值顯著大于2型糖尿病組(P<0.05)，而兩組患者的FINS比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組血糖相關指標比較

2.4 血清LncRNA H19表達水平與相關指標的關系 根據(jù)Pearson相關分析結果顯示，2型糖尿病合并NAFLD患者血清LncRNA H19表達水平與TG、LDL-C、TC、FPG、HbA1C、HOMA-IR均呈正相關(r=0.354、0.249、0.348、0.431、0.276、0.402，P=0.000、0.009、0.000、0.000、0.004、0.000)。見圖2。

圖2 2型糖尿病合并NAFLD患者血清LncRNA H19表達水平與相關指標的關系分析

2.5 影響2型糖尿病患者NAFLD發(fā)生的危險因素分析 以2型糖尿病患者NAFLD是否發(fā)生作為因變量(未發(fā)生=0，發(fā)生=1)，以TG、LDL-C、TC、FPG、HbA1C、HOMA-IR、LncRNA H19作為自變量(均為實測值)進行分析。結果顯示HOMA-IR、LncRNA H19均為影響2型糖尿病患者NAFLD發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)。見表4、5。

表4 影響2型糖尿病患者NAFLD發(fā)生的單因素logistic回歸分析

表5 影響2型糖尿病患者NAFLD發(fā)生的多因素logistic回歸分析

3 討論

NAFLD為患者無過量飲酒史，且出現(xiàn)的以肝實質細胞脂肪病變和脂肪蓄積為主要特征的一種臨床綜合征，該病具有發(fā)病率高、病情嚴重等特點[11]。糖尿病是一種臨床上較常見、且嚴重威脅人類健康的慢性疾病，其危害性在全球各疾病中占據(jù)第3位，且近年來其患病率迅速上升，而在糖尿病患者中約有90%為2型糖尿病患者[12]。2型糖尿病合并NAFLD 是2型糖尿病中常見的一種并發(fā)癥，據(jù)報道顯示，2型糖尿病患者中NAFLD的發(fā)病率超過70%[13]。流行病學研究顯示，在中國2型糖尿病合并NAFLD的在糖尿病人群中患病率大于40%，并呈逐年上升的趨勢，嚴重影響人們的健康及生活質量，且給患者家庭帶來巨大經(jīng)濟負擔。然而，目前對2型糖尿病合并NAFLD的病因及具體的發(fā)病機制尚不完全清楚，因此，對其發(fā)病機制進行深入研究，以尋找新的疾病標志物并研究其與胰島素抵抗的關系具有重要的臨床意義。

LncRNAs是人類基因組中一類長度大于200 個核苷酸、結構與mRNA類似的基因轉錄本，其本身不被翻譯為蛋白質，但在轉錄后可控制基因的表達。大量研究已證實，LncRNA參與多種生物學機制，并在多種癌癥及各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[14]。LncRNA H19是人們首個發(fā)現(xiàn)的一個長度為2.3 kb并具有基因印記功能的LncRNA，位于11p15.5號染色體上。有研究顯示，LncRNA H19與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關[15]。孫雅愷[16]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19與結直腸腫瘤密切相關，且可作為結直腸腫瘤診斷及治療的重要依據(jù)。黃珊珊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA H19能調節(jié)胰島素樣生長因子受體表達，在糖尿病中發(fā)揮一定作用，并可成為糖尿病診斷的潛在標志物。本研究結果顯示，2型糖尿病合并NAFLD組血清LncRNA H19表達水平顯著高于2型糖尿病組，提示血清LncRNA H19可能參與2型糖尿病合并NAFLD的發(fā)展進程。

胰島素抵抗即為胰島素在進行正常生物作用時敏感性下降，脂肪及肌肉組織對葡萄糖的利用率降低。目前，臨床上測試胰島素抵抗的主要方法是通過測量空腹血糖和空腹胰島素計算得出HOMA-IR[18]。大量研究已證實，胰島素抵抗與2型糖尿病、高血壓、NAFLD及血脂異常等多種心血管疾病密切相關。近年來，隨著人們對胰島素抵抗研究的深入，發(fā)現(xiàn)改善胰島素抵抗對改善糖尿病的病情具有重要作用。徐海波等[19]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者血清pannexin-1表達水平顯著升高，且與胰島素抵抗及2型糖尿病的病理過程密切相關。李偉等[20]研究發(fā)現(xiàn)，內臟脂肪含量對新發(fā)2型糖尿病患者的胰島素抵抗影響較大。本研究結果顯示，2型糖尿病合并NAFLD組HOMA-IR、HbA1C水平顯著高于2型糖尿病組，提示胰島素抵抗相關指數(shù)可能判斷代謝性疾病病情的嚴重程度。且2型糖尿病合并NAFLD患者血清LncRNA H19表達水平與TG、LDL-C、TC、FPG、HbA1C、HOMA-IR呈明顯正相關，提示LncRNA H19可能通過某種機制參與調控2型糖尿病合并NAFLD的發(fā)生及發(fā)展，需進一步進行驗證。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，HOMA-IR、LncRNA H19均為影響2型糖尿病患者NAFLD發(fā)生的獨立危險因素，提示臨床需注意HOMA-IR及LncRNA H19表達水平升高的患者，以期為評估2型糖尿病患者NAFLD的發(fā)生及病情進展提供幫助。

綜上所述，LncRNA H19在2型糖尿病合并NAFLD患者血清中的表達水平明顯升高，且與胰島素抵抗密切相關，提示血清LncRNA H19可作為2型糖尿病合并NAFLD病情評估的潛在生物學指標。但本研究因納入例數(shù)偏少可能影響結果，存在一定偏倚，為明確提高研究精確性，后期應在大量樣本基礎上進行深入探究。

利益相關聲明：所有作者聲明無利益沖突。

作者貢獻說明：馮姍姍是本研究的實驗設計者和實驗研究的執(zhí)行人，完成數(shù)據(jù)分析，論文初稿的寫作；索艷參與實驗設計和試驗結果分析；王肅是項目的構思者及負責人，指導實驗設計、數(shù)據(jù)分析、論文寫作與修改。