李莎, 羅磊, 黃邵玲, 李繼猛, 熊艷艷, 朱雪芹, 謝穎△

1長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心(湖南長(zhǎng)沙 410004)；2湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子流行病學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖南長(zhǎng)沙 410081)

金屬硫蛋白(metallothionein protein, MT)的結(jié)構(gòu)在生物進(jìn)化中高度保守，有4種異構(gòu)體 MT-1、MT-2、MT-3和 MT-4。MT-1和 MT-2在大多數(shù)哺乳動(dòng)物的內(nèi)臟器官中廣泛存在，尤以肝、腎細(xì)胞為主，而且參加其外源化學(xué)物代謝功能的調(diào)節(jié)[1-2]。腎臟是機(jī)體代謝解毒的重要器官，其對(duì)外界應(yīng)激或中間代謝產(chǎn)物超過腎臟代償能力可引起腎功能障礙，如改變腎小球血流速率和流體壓力、受損腎臟細(xì)胞通過細(xì)胞適應(yīng)和細(xì)胞增殖等途徑恢復(fù)或修復(fù)腎單位結(jié)構(gòu)和生物功能等，在此過程中常常伴有金屬硫蛋白含量的升高。由于金屬硫蛋白的易與二價(jià)金屬結(jié)合的特殊結(jié)構(gòu)和抗氧化作用，使其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生代償性保護(hù)作用，保護(hù)部位可能在細(xì)胞核，可以使DNA雙鏈保持穩(wěn)定，避免形成DNA加和物以減輕氧化損傷，金屬硫蛋白比谷胱甘肽具有抗核氧化作用更為明顯[3]。據(jù)報(bào)道金屬硫蛋白除可保護(hù)細(xì)胞拮抗氧化損傷外，可能還參與機(jī)體微量元素的代謝和重金屬解毒等作用[4]。為了進(jìn)一步研究金屬硫蛋白在外源化學(xué)物對(duì)腎臟不良生物學(xué)作用的保護(hù)機(jī)制，本研究2019年1月至2021年10月主要使用LV5(EF-1aF/GFP&Puro)質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)MT-1E的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞株，為后續(xù)開展金屬硫蛋白的生物學(xué)功能研究提供分子水平的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，載體為L(zhǎng)V5(EF-1aF/GFP&Puro)質(zhì)粒，克隆位點(diǎn)NotI/BamHI，含綠色熒光蛋白EGFP。HK-2細(xì)胞采用含10%胎牛血清和1%鏈霉素-青霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基(含1.5 mg/L Glutamine, 100 U/mL Penicillin, 100 μg/mL Streptomycin)，37℃ 5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。本次研究經(jīng)長(zhǎng)沙市疾病預(yù)防控制中心倫理委員會(huì)討論審核通過(批準(zhǔn)號(hào)：CSCDC-2021-09)。

1.2 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、胎牛血清FBS(BI)、PBS(Life Science Products & Services)、Trypsin-EDTA Solution(Hyclone)、Anti-MT-1E抗體(ab193623)、6孔板(Corning)、24孔板(Corning)、6 cm & 10 cm培養(yǎng)皿(Corning)、過表達(dá)病毒液(吉瑪基因)、RNAi-Mate轉(zhuǎn)染試劑(吉瑪基因)、Lentivirus-NC病毒液(吉瑪基因)、Puromycin(Merck)、Cat# GMRS-001實(shí)時(shí)熒光定量通用試劑(吉瑪基因)、ABI stepone plus 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(LIfe)、FRESCO17高速冷凍離心機(jī)(Thermo)、NanoDrop2000分光光度計(jì)(Thermo)、Eclipse TS100-F倒置顯微鏡(Nikon)、Eclipse Ti-u倒置熒光顯微鏡(Nikon)、Multimode reader2300多功能酶標(biāo)儀(PerkinElmer)、Milli-Q純水儀(Millipore)。

1.3 細(xì)胞侵染效率檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞接種于24孔板，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)過夜；取病毒液按1∶5、1∶10、1∶20與培養(yǎng)基混合稀釋，總體積500 μL；棄去上層培養(yǎng)基，加入病毒梯度稀釋液，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h；棄去病毒梯度稀釋液，加入新鮮培養(yǎng)基，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)72 h，于熒光倒置顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.4 細(xì)胞浸染實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞接種于6孔板，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)過夜；取實(shí)驗(yàn)用病毒液按1∶10與培養(yǎng)基混合稀釋；棄去上層培養(yǎng)基，加入實(shí)驗(yàn)用病毒稀釋液，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)24 h；棄去病毒稀釋液，加入新鮮培養(yǎng)基，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)。

1.5 最小致死濃度檢測(cè) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HK-2細(xì)胞接種于24孔板，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)過夜；用完全培養(yǎng)基稀釋嘌呤霉素(puromycin)至4 μg/mL，兩倍倍比稀釋，最小濃度至0.25 μg/mL，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)7 d，于倒置顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果。

1.6 穩(wěn)定過表達(dá)篩選及鑒定 根據(jù)最小致死濃度檢測(cè)結(jié)果，在培養(yǎng)基加入4 μg/mL 的嘌呤霉素(puromycin)，37℃ 5% CO2常規(guī)培養(yǎng)，于熒光倒置顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果；引物設(shè)計(jì)序列如下，MT-1E，h-MT-1E-fo1，TCAGGTTGGGAGGGAACTCAA，h-MT-1E-re1，GAAAGCCTGGAGAGGGAATGA，擴(kuò)增長(zhǎng)度為101 bp，HGAPDH，HGAPDH-FO，CATGAGAAGTATGACAACAGCCT，HGAPDH-RE，AGTCCTTCCACGATACCAAAGT，擴(kuò)增長(zhǎng)度為113 bp；mRNA 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，RNA 模板、無RNase水、隨機(jī)引物 N6[100 μmol/L]、5× 逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTP[10 mmol/L]、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)、RNasin[40 U/μL]；實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)體系，2×Real-time PCR Master Mix、primer set(5 μmol/L)、ROX校準(zhǔn)染料(50×)1、rTaq DNA 聚合酶(5 U/μL)、Template、ddH2O；實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件，逆轉(zhuǎn)錄階段(70℃ 5 min、37℃ 60 min、85℃ 10 min、4℃)，mRNA實(shí)時(shí)熒光定量階段(94℃ 3 min、94℃ 12 s、62℃ 30 s、72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán))。陰性對(duì)照細(xì)胞組為轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒HK-2細(xì)胞，高表達(dá)慢病毒穩(wěn)篩細(xì)胞組為高表達(dá)MT-1E細(xì)胞組利用慢病毒載體轉(zhuǎn)入HK-2細(xì)胞組。對(duì)轉(zhuǎn)染成功后的腎小管上皮HK-2細(xì)胞提取總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及蛋白印跡分析鑒定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用Odyssey軟件分析不同分組蛋白印跡灰度值，各蛋白條帶灰度值采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，組間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 浸染效率檢測(cè) 通過明光視野和熒光視野200×鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)病毒液與培養(yǎng)基1∶10稀釋侵染72 h，細(xì)胞侵染效率可大于80%，見圖1。

注：A：空白細(xì)胞；B：1∶5稀釋浸染；C：1∶10稀釋浸染；D：1∶20稀釋浸染

2.2 細(xì)胞浸染實(shí)驗(yàn) 病毒液與培養(yǎng)基1∶10稀釋侵染72 h后，在明光視野和熒光視野100×鏡下觀察浸染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)可達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。見圖2。

注：A：空白細(xì)胞狀態(tài)；B：浸染對(duì)照狀態(tài)；C：浸染高表達(dá)狀態(tài)

2.3 最小致死濃度檢測(cè) 由圖3可見，經(jīng)過0.25、0.5、1、2、4 μg/mL梯度濃度摸索，鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)分析嘌呤霉素(puromycin)最小致死濃度為4 μg/mL，可用此濃度進(jìn)行細(xì)胞篩選以開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

注：A：空白細(xì)胞；B：0.25 μg/mL濃度；C：0.5 μg/mL濃度；D：1 μg/mL濃度；E：2 μg/mL濃度；F：4 μg/mL濃度

2.4 質(zhì)粒DNA測(cè)序及高表達(dá)細(xì)胞株鑒定 RT-PCR電泳結(jié)果顯示GAPDH、MT-1E基因PCR產(chǎn)物大小正確，無雜帶說明引物特異性好(圖4)，測(cè)定A260/A280比值陰性對(duì)照細(xì)胞組(2.025～2.033)和高表達(dá)慢病毒穩(wěn)篩細(xì)胞組(1.968～1.972)的OD值均在1.9～2.2之間，表明提取過程中沒有蛋白污染，可用于后續(xù)試驗(yàn)。對(duì)轉(zhuǎn)入MT-1E基因的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，通過基因序列比對(duì)，測(cè)序結(jié)果與目的序列一致，見圖5。

注：A：GADPH組；B：MT-1E組

圖5 MT-1E基因測(cè)序圖

明光視野和熒光視野100×鏡下可見，高表達(dá)慢病毒穩(wěn)篩細(xì)胞組形態(tài)如圖6所示。Westem blot結(jié)果顯示，對(duì)照組MT-1E/GAPDH蛋白表達(dá)水平為0.26±0.09，高表達(dá)MT-1E組為0.71±0.21。高表達(dá)慢病毒穩(wěn)篩細(xì)胞組的MT-1E蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.89，P=0.016)，表明高表達(dá)MT-1E的LV5(EF-1aF/GFP & Puro)質(zhì)粒明顯增加MT-1E蛋白表達(dá)量，見圖7。

3 討論

金屬硫蛋白是富含半胱氨酸殘基的小分子量金屬結(jié)合蛋白，其主要的生物學(xué)功能之一是與重金屬在機(jī)體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)，從而提高機(jī)體對(duì)重金屬毒性的代償能力，如破壁靈芝孢子粉等可誘導(dǎo)金屬硫蛋白表達(dá)，具有拮抗大鼠發(fā)生鎘中毒且降低鎘暴露肝臟毒性的功效[5]。一些金屬離子(如Cd2+、As3+等)可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白的表達(dá)增加，且與外源性化學(xué)物所致細(xì)胞氧化損傷修復(fù)相關(guān)[6]。有學(xué)者[7]通過分子生物信息學(xué)的方法利用微陣列矩陣分析，可見長(zhǎng)期吸煙也可能會(huì)引起氣道金屬硫蛋白表達(dá)上升，金屬硫蛋白mRNA序列中包含“CTCCTGC”片段，可與has-miR-4722-5p區(qū)域匹配。李柯樺等[8]通過2015—2018年的隊(duì)列研究，利用logistic回歸模型分析暴露于鉛鎘錳等金屬環(huán)境下的風(fēng)險(xiǎn)因素，結(jié)果顯示金屬硫蛋白可能與機(jī)體重金屬解毒和自由基清除等生物學(xué)功能均有關(guān)。鋅可對(duì)鎘引起的巨噬細(xì)胞毒性起到拮抗作用，其分子機(jī)制是通過金屬硫蛋白的合成表達(dá)調(diào)節(jié)金屬轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而與鎘性巨噬細(xì)胞毒性產(chǎn)生聯(lián)合毒性作用，期間常伴有形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的改變[9]。通過超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)機(jī)體表達(dá)的金屬硫蛋白具有20個(gè)半胱氨酸配體的互補(bǔ)物，且以類似四面體配位幾何結(jié)構(gòu)可結(jié)合多達(dá)7種二價(jià)金屬離子，盡管金屬硫蛋白分子序列相對(duì)保守，但其與金屬離子結(jié)合后的可表現(xiàn)出易于結(jié)合的生物學(xué)功能[10]。

慢病毒載體是較常用的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，一般安全性較高的載體會(huì)加入一段反式作用因子修飾，以避免子代病毒的自我復(fù)制。本研究所使用的LV5(EF-1aF/GFP&Puro)質(zhì)粒載體，對(duì)5＇和3＇LTR分別進(jìn)行了刪除改造，使載體復(fù)制不具有增強(qiáng)活性。盡管如此改進(jìn)后的慢病毒載體安全性有所提高，但實(shí)驗(yàn)過程中仍應(yīng)盡可能在BSL2級(jí)的生物安全柜中進(jìn)行，且實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范操作，避免慢病毒載體接觸到口鼻眼等身體開放性區(qū)域。實(shí)驗(yàn)操作后實(shí)驗(yàn)器具均應(yīng)高溫滅菌消毒，實(shí)驗(yàn)臺(tái)面可用70%酒精擦拭，有液滴附著的臺(tái)面，還應(yīng)使用0.6%次氯酸鈉溶液浸泡1 h以上。嘌呤霉素是一種常見的蛋白質(zhì)合成抑制劑，其對(duì)蛋白質(zhì)翻譯過程有生物學(xué)作用，類似于tRNA分子末端結(jié)構(gòu)能夠?qū)⒐矁r(jià)連接到核糖體多肽鏈上以終止翻譯過程[11]。針對(duì)嘌呤霉素細(xì)胞抗性的編碼位點(diǎn)主要是嘌呤霉素N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的Pac基因位點(diǎn)，當(dāng)含有Pac基因的質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)Pac基因后，可產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)所需抗性進(jìn)而用于細(xì)胞篩選。

利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建高表達(dá)某個(gè)基因的細(xì)胞株是研究基因生物學(xué)功能的一種常用方法，黃曉等[12]使用嘌呤霉素篩選陽性克隆，構(gòu)建高表達(dá)miR-17-92的小鼠白血病L1210細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染效率高，目的基因表達(dá)穩(wěn)定。為了能夠確保轉(zhuǎn)染效率，采用酶切及測(cè)序的方法檢測(cè)構(gòu)建的質(zhì)粒是否符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求也是構(gòu)建高表達(dá)細(xì)胞株必不可少的一環(huán)[13]。熊永福等[14]認(rèn)為傳統(tǒng)的基因過表達(dá)技術(shù)以理化方法為主，其對(duì)細(xì)胞株損傷較重，適用范圍較小且不適宜用于穩(wěn)轉(zhuǎn)株的制備，而以慢病毒轉(zhuǎn)染為代表的生物載體體系則可最大限度減少外源基因片段對(duì)細(xì)胞自身遺傳相關(guān)特性的影響。本研究使用LV5(EF-1aF/GFP&Puro)質(zhì)粒載體，利用嘌呤霉素篩選，構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)MT-1E的方法是可行的。許淑文等[15]使用GV143質(zhì)粒載體將TGF-β1基因整合至心肌H9c2細(xì)胞，使用熒光顯微鏡觀察可見轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組mRNA水平顯著升高。本研究通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，將MT-1E轉(zhuǎn)染至人腎小管上皮HK-2細(xì)胞株中，并使用嘌呤霉素對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行篩選，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，蛋白免疫印跡技術(shù)進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株的表達(dá)鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明經(jīng)過轉(zhuǎn)染的HK-2細(xì)胞株可MT-1E基因蛋白表達(dá)量升高，可用于后續(xù)腎小管上皮細(xì)胞中MT的生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：李莎、黃邵玲負(fù)責(zé)論文撰寫及修改；李繼猛負(fù)責(zé)提出工作設(shè)想及方案；羅磊、熊艷艷、朱雪芹負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)過程；謝穎負(fù)責(zé)指導(dǎo)論文寫作和關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)。