重癥急性胰腺炎(SAP)是一種以高發(fā)病率、高致死率為特征的消化系統(tǒng)疾病，目前發(fā)病機制尚不明確。主流觀點認為多種原因?qū)е碌囊认僮陨硐梢鹑硌装Y反應綜合征，進而誘發(fā)多器官功能衰竭，是導致患者死亡的主要原因。本課題組前期研究證實，引流SAP早期產(chǎn)生的胰源性腹水（PAAF）即行腹腔穿刺引流術（APD）可顯著降低重癥急性胰腺炎病人的全身炎癥反應，對重要臟器起到保護作用。然而APD減輕胰腺損傷的具體機制目前尚不完全明了。

既往研究表明，受損的自噬介導腺泡細胞空泡化及胰蛋白酶原的激活，是導致急性胰腺炎（AP）發(fā)生與惡化的重要因素，而APD與自噬間是否存在聯(lián)系尚未得到證實。核因子E2相關因子2(Nrf-2）作為內(nèi)源性抗氧化通路的關鍵因子，通過Nrf-2/抗氧化反應元件（ARE）信號通路上調(diào)其下游的血紅素合酶-1（HO-1）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶的表達，在胰腺炎等炎癥性疾病中發(fā)揮重要的保護作用。同時，Nrf2/HO-1通路還參與自噬調(diào)節(jié)。因此，我們推測APD可以通過激活Nrf2/HO-1通路并改善腺泡細胞的自噬活動，從而成為早期治療SAP的重要手段?；诖?，本實驗擬從影響SAP大鼠腺泡細胞內(nèi)自噬及Nrf-2/HO-1信號通路的角度探討APD的治療機制，為APD的臨床應用提供證據(jù)，并為未來探索更多SAP治療手段提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF 級8～9 周齡雄性SD 大鼠32 只，體質(zhì)量210～230 g，購自成都達碩動物科技有限公司；?；悄懰徕c、鋅原卟啉（ZnPP）（Sigma-Aldrich）；TNF-α、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（江萊生物）；Trizol、全蛋白/核蛋白提取試劑盒（索萊寶）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（碧云天）；丙二醛（MDA）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、還原性谷胱甘肽（GSH）測定試劑盒（建成生物）；兔抗大鼠HO-1、Nrf-2、p62 抗體（Cell Signaling Technology）；兔抗大鼠LC-3B抗體（Abcam）；兔抗大鼠β-actin抗體、兔抗大鼠PCNA抗體、山羊抗兔二抗（武漢三鷹）；吸入性麻醉劑異氟烷（瑞沃德）。

1.2 動物模型及制備

大鼠飼養(yǎng)于獨立通氣籠具（IVC），不限飲食，12 h/12 h晝夜循環(huán)，適應喂養(yǎng)1周后進行試驗。將32只雄性大鼠隨機分為4組：假手術組（SO組），SAP組，APD組，APD干預+HO-1特異性抑制劑組（APD+ZnPP組），每組8只。SO組為開腹后翻動胰腺數(shù)次后關腹。SAP組為使用4%?；悄懰徕c沿胰管逆行注射法制備SAP模型。APD組處理方法參考本課題組已發(fā)表文獻［10］，即SAP 建模后于右下腹放置引流管后關腹。APD+ZnPP組為建模前12 h腹腔注射ZnPP 30 mg/kg，其余操作同APD組。所有大鼠于建膜后12 h處死并收集血樣、胰腺組織備用。所有實驗過程均符合單位和國家有關實驗動物管理和使用的規(guī)定。

1.3 動物取材方法

大鼠行異氟烷吸入麻醉后開腹，行腹主動脈采血，血樣于冰上靜置30 min后離心（3500 r/min，10 min），取上清液并保存于-80 ℃冰箱。行生理鹽水灌洗后，沿十二指腸剪下胰腺，取5 mm×5 mm組織塊放置于4%多聚甲醛中固定。剩余胰腺組織分裝后使用液氮速凍，待取材完成后轉(zhuǎn)移并保存于-80 ℃冰箱。

1.4 胰腺組織病理學評價

胰腺組織固定后行脫水、石蠟包埋、切片、HE 染色。于顯微鏡下觀察胰腺組織病理變化。依據(jù)Schmidt等報道的標準，對胰腺水腫、出血、腺泡細胞壞死、炎癥細胞浸潤等進行評分，計算10個獨立視野，取平均分作為每張切片的最終評分。

灌區(qū)內(nèi)兩個氣象站計算得到的春玉米日需水量變化過程和高度一致。計算得到春玉米生育期內(nèi)總需水量約為510 mm，該值與趙春林在充分供水條件下（灌水量261～304 mm）得到的春玉米耗水量505.5～506.2 mm一致[15]。在春玉米總需水量中，苗期、生長期、開花灌漿期和成熟期的需水量分別占總需水量的15%、38%、3%6和11%，各階段的日需水量分別約為2.4 mm/d、3.9 mm/d、4.3 mm/d和2.3 mm/d，生育期日需水量為3.3 mm/d?？梢钥闯?，作物需水最關鍵的時期為開花灌漿期，其次為生長期，成熟期和苗期的日需水量較小。

下面我們以兩部仙俠小說為例，探討外譯策略?！侗P龍》講述了一個擁有‘盤龍戒指’的少年踏上夢幻之旅的故事。

1.5 胰腺亞細胞結構觀察

ELISA結果顯示，SAP組血清中TNF-α、IL-1β水平較SO組顯著提升（＜0.05），APD組炎癥因子TNF-α、IL-1β水平較SAP組降低（＜0.05，圖2A）。

1.6 血清淀粉酶，脂肪酶及血清炎癥因子的測定

4.可實現(xiàn)深入校企聯(lián)合，對口培養(yǎng)。提高學生的技能水平，夯實知識基礎，增加就業(yè)競爭力。研發(fā)完成“大型養(yǎng)路機械3D模擬仿真培訓基地”。

1.7 實時定量PCR（RT-PCR）

采用Trizol 法提取胰腺組織內(nèi)總mRNA，使用NanoDrop ND-2000儀（Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA）測定每個樣品的mRNA濃度及純度，純度以/表示，所獲得的mRNA純度均在1.9～2.0。每個樣品根據(jù)濃度稀釋為50μg/mL后采用一步法SYBR PrimeScript TM RT-PCR試劑盒II(Takara）通過C1000 TM Thermal Cycler(Bio-Rad）儀器進行檢測。PCR條件如下：42 ℃5 min；95 ℃5 s、60 ℃30 s，進行40個循環(huán)。數(shù)據(jù)采用2法進行分析。引物序列見表1。

1.8 Western blotting

分別采用全蛋白提取試劑盒與核蛋白提取試劑盒提取胰腺組織全蛋白與核蛋白（核蛋白使用新鮮組織；全蛋白使用凍存組織），并用Bradford 法測定蛋白濃度。進行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、發(fā)光?？偟鞍撞捎忙?actin作為內(nèi)參，核蛋白采用PCNA作為內(nèi)參。使用Azure biosystems 300發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白表達。

1.9 氧化應激指標測定

使用試劑盒測定胰腺組織內(nèi)丙二醛(MDA)、SOD、谷胱甘肽（GSH）的活性。

1.10 統(tǒng)計學方法

2.2.1 對照品溶液 精密稱取在五氧化二磷中干燥12 h后的米索硝唑?qū)φ掌?2.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制成米索硝唑質(zhì)量濃度為0.48 mg/mL的對照品溶液。

胰腺組織透射電鏡顯示，SAP組腺泡細胞內(nèi)出現(xiàn)大量酶原顆粒，伴有線粒體腫脹與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，同時出現(xiàn)多量自噬小泡形成。APD組酶原顆粒較SAP組有所減少，線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷情況有所改善（圖3）。

2 結果

2.1 APD對胰腺組織病理損傷及脂肪酶、淀粉酶的影響

Western blotting檢測結果顯示，胰腺組織內(nèi)自噬相關分子LC-3B與p62在SAP組中有顯著上升，APD組p62水平較SAP組有顯著下降（＜0.05，圖4）。

使用全自動生化分析儀測定血清淀粉酶、脂肪酶，使用ELISA試劑盒測定炎癥因子IL-1β、TNF-α。

2.2 APD對血清炎癥因子的影響

取材后樣本經(jīng)3%戊二醛預固定，1%四氧化鋨再固定，丙酮逐級脫水，Ep812包埋，半薄切片用甲苯胺藍染色作光學定位，用鉆石刀作超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色JEM-1400FLASH透射電鏡觀察。

采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。組間比較采用單因素ANOVA 分析，兩組間進一步比較采用LSD-檢驗分析。＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 APD對胰腺組織內(nèi)氧化應激水平的影響

SAP組較SO組胰腺內(nèi)MDA水平上升，SOD、GSH水平下降（＜0.05）。在APD治療后胰腺組織內(nèi)MDA水平較SAP組顯著降低，GSH水平較SAP組顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（＜0.05），SOD水平較SAP組增高，但差異無統(tǒng)計學意義（＞0.05，圖2B）。

2.4 APD對胰腺腺泡細胞亞細胞器結構及自噬的影響

羅爹爹說：”話是這樣說，但就怕大家受不住，已經(jīng)都聽了一個星期了。我這兩天腿子走不得，沒有去打拳，我也聽得心里慌慌神。你曉得，這個音樂蠻不吉利?！?/p>

胰腺組織HE染色結果顯示，SO組胰腺組織結構基本正常，SAP組出現(xiàn)了明顯的出血、水腫、腺泡細胞壞死，胰腺小葉結構破壞明顯，病理學評分增高（＜0.05）；與SAP組相比，APD組胰腺組織損傷明顯減輕，病理學評分降低（＜0.05，圖1A、B)。SAP組血清淀粉酶、脂肪酶水平較SO組顯著升高（＜0.05），APD組較SAP組降低（＜0.05，圖1C、D）。

2.5 APD對胰腺組織Nrf-2/HO-1通路的影響

RT-PCR結果顯示，APD組HO-1的mRNA表達顯著高于SAP組（＜0.05，圖5A）。Western blotting檢測結果提示，SAP 組相較SO 組HO-1 表達水平顯著提高，核Nrf-2水平顯著降低（＜0.05）；同時與SAP組相比，APD 組HO-1 與核Nrf-2 水平顯著上升（＜0.05，圖5B）。

2.6 抑制HO-1后，APD對胰腺損傷及相關指標的影響

對APD 組使用HO-1 分子抑制劑ZnPP 后，Western blotting結果顯示APD+ZnPP組胰腺組織HO-1分子表達較APD組明顯降低（圖6A）。與APD組相比，APD+ZnPP組胰腺組織病理損傷更加嚴重（＜0.05，圖6E）；血清淀粉酶、脂肪酶水平顯著提高（＜0.05，圖6D）；血清炎癥因子水平顯著提高（＜0.05，圖6C）；胰腺組織內(nèi)MDA水平顯著上升，SOD、GSH水平顯著下降（＜0.05，圖6B）。

3 討論

前期的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺炎早期通過APD去除PAAF可以顯著降低病人的全身炎癥反應，延緩或避免多器官功能衰竭，且不會增加感染風險。有研究證實，APD可通過促進腺泡細胞凋亡，調(diào)控巨噬細胞極化等方式對SAP起到保護作用。自噬是胰腺炎發(fā)生與發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，PAAF中含有的有毒物質(zhì)可能通過JNK、PI3K/Akt等多種途徑影響自噬，但目前其在APD中的作用尚未得到研究。本研究采用4%?；悄懰徕c逆行注射法造SAP模型，在造模后12 h，所有大鼠均出現(xiàn)大量腹水。行APD治療后，大鼠血清內(nèi)促炎因子、淀粉酶、脂肪酶水平均顯著降低，胰腺病理損傷程度減輕，提示APD治療有效，與我們先前的研究結果一致。并且我們發(fā)現(xiàn)APD治療后腺泡細胞自噬受損現(xiàn)象得到緩解。

重癥急性胰腺炎中腺泡細胞的損傷與炎癥、自噬、氧化應激等關系密切。既往研究表明，氧化應激產(chǎn)生的活性氧能夠調(diào)控自噬活動。受損的自噬會造成毒性蛋白的聚集與線粒體損傷，進一步加劇氧化應激損傷。自噬受損導致自噬體在腺泡細胞中的積累造成腺泡細胞空泡化和胰蛋白酶積累是SAP的關鍵病理反應。本研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)SAP后胰腺組織內(nèi)氧化與抗氧化平衡失調(diào)，氧化水平提高，抗氧化水平降低，在APD干預后胰腺組織內(nèi)氧化與抗氧化水平均向生理狀態(tài)轉(zhuǎn)移。在急性胰腺炎中，氧化應激被視為自噬損傷的中介因子。本研究通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，SAP組大鼠腺泡細胞內(nèi)自噬小體與酶原顆粒數(shù)量增多，并出現(xiàn)不同程度的線粒體損傷，提示誘發(fā)SAP后自噬增加。自噬相關蛋白是調(diào)節(jié)自噬過程的主要效應分子，其中LC-3B與p62是反應自噬不同階段功能是否完整的標志。當自噬發(fā)生時，I型LC-3經(jīng)過泛素化加工結合至自噬膜表面，形成LC-3B，其含量與自噬小泡的多少呈正相關。而p62則是連接泛素化底物與LC-3B的轉(zhuǎn)運蛋白，當p62與底物結合進入溶酶體后即被降解，因此p62的含量常用來反應自噬活力。本研究發(fā)現(xiàn)SAP建模后胰腺組織內(nèi)LC-3B與p62表達水平同步提升，符合自噬受損的表現(xiàn)，在使用APD干預后可見p62表達水平顯著降低，提示自噬受損受到抑制，其作用可能與胰腺組織內(nèi)氧化應激水平降低有關。

醫(yī)院要完善新醫(yī)改下的精細化管理工作，就需要有力的財經(jīng)管理部門作為支撐，按照《醫(yī)院財務制度》，實施全面預算管理，著力成本控制，有效防范風險，達成綜合績效目標，使財務工作實現(xiàn)閉環(huán)式管理。通過建立管理會計制度，促進醫(yī)院財務精細化，科學化管理，優(yōu)化流程，提升組織效率。但是，在這個階段，醫(yī)院財務人員的整體規(guī)模不足。這表明在推進管理會計的過程中，管理型人才實力就更加緊缺。

Nrf-2/HO-1信號軸是一條多臟器保護鏈，在自噬、抗氧化、調(diào)節(jié)炎癥等多方面發(fā)揮重要作用，被視為自噬與氧化應激之間的耦合機制。目前已有多項研究表明，HO-1在多種疾病中起到重要的保護作用：HO-1不僅自身可促進多種細胞中的自噬并抑制凋亡，也分解血紅素為膽綠素、Fe與CO。其中CO被證實可通過抑制NF-kb通路進而降低急性胰腺炎的嚴重程度，膽綠素具有較強的抗氧化能力，并且具有清除ROS的能力。本研究發(fā)現(xiàn)，SAP發(fā)生后早期產(chǎn)生的PAAF可抑制Nrf-2核轉(zhuǎn)位。通過APD引流腹水后Nrf-2核轉(zhuǎn)位顯著增強，HO-1分子表達水平顯著提升，組織內(nèi)氧化應激水平受到抑制。在應用HO-1 特異性分子抑制劑ZnPP后，APD治療效果減退，相比于APD組，胰腺損傷增加、炎癥與氧化應激水平顯著提高，提示Nrf-2/HO-1通路在APD治療SAP的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，APD可通過引流PAAF造成胰腺組織內(nèi)Nrf-2/HO-1通路的顯著上調(diào)，導致胰腺組織內(nèi)氧化應激水平降低。本研究APD引流后，SAP大鼠腺泡細胞自噬受損情況明顯改善，其可能與胰腺組織內(nèi)氧化應激水平減少、Nrf-2/HO-1通路激活有關，為APD治療重癥急性胰腺炎提供了新的理論依據(jù)。