慢性心肌缺血除導(dǎo)致急性冠脈綜合征外，可繼發(fā)缺血性心肌?。↖HD），引起心肌細(xì)胞凋亡、壞死，心肌纖維化重構(gòu)，嚴(yán)重?fù)p害心臟功能，甚至導(dǎo)致死亡。此外，心肌缺血可繼發(fā)多種心律失常，以心房顫動(dòng)(AF）最多見。AF可誘發(fā)卒中和體循環(huán)動(dòng)脈栓塞，研究表明AF患者缺血性卒中風(fēng)險(xiǎn)是非AF患者的4～5倍。心肌缺血繼發(fā)AF的具體機(jī)制尚不清楚，大量證據(jù)提示缺血引起的心肌細(xì)胞凋亡在其中扮演重要角色。然而，目前針對(duì)細(xì)胞凋亡的干預(yù)措施效果并不理想，亟待開發(fā)新的治療靶點(diǎn)。

近年來，RNA 在人體生理、病理過程中的重要作用被不斷揭示。研究發(fā)現(xiàn)，敲低長(zhǎng)鏈非編碼RNAZFAS1可以抑制心梗大鼠心肌細(xì)胞凋亡。mRNA 降解與線粒體損傷密切相關(guān)，是促使細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。廣泛的mRNA 降解是細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)志性特征，它的出現(xiàn)甚至早于膜脂質(zhì)紊亂、DNA 斷裂及翻譯起始因子失活。有研究表明，許多編碼功能蛋白的mRNA在凋亡的非洲爪蛙卵中明顯降解，以管家基因最為顯著，更有學(xué)者在植物和酵母菌發(fā)生凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)了rRNA和mRNA的裂解。此外，通過CD95等死亡受體誘導(dǎo)小鼠胸腺細(xì)胞凋亡后，細(xì)胞內(nèi)包括管家基因在內(nèi)的大量mRNA發(fā)生了降解。但截至目前，凋亡相關(guān)mRNA的降解是否影響心肌細(xì)胞的凋亡尚不清楚。

中國工程院院士、中冶建筑研究院有限公司董事長(zhǎng)越清瑞，株洲市副市長(zhǎng)何朝暉，中國工程建設(shè)焊接協(xié)會(huì)常務(wù)副會(huì)長(zhǎng)劉景鳳等領(lǐng)導(dǎo)以及來自科研院所、高校的知名教授、學(xué)者，工程建設(shè)行業(yè)施工企業(yè)、焊接設(shè)備材料制造企業(yè)的專家、技術(shù)人員等共計(jì)220名代表參加了本次會(huì)議，《金屬加工》雜志作為該活動(dòng)的支持媒體也應(yīng)邀出席了本次活動(dòng)。

多核糖核苷酸核苷轉(zhuǎn)移酶1（PNPT1)是一種高度進(jìn)化的保守基因，其編碼的PNPT1蛋白主要定位于線粒體膜間隙內(nèi)。功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在HCT 116細(xì)胞中線粒體內(nèi)的PNPT1主要發(fā)揮RNA轉(zhuǎn)運(yùn)功能，而泄露至細(xì)胞質(zhì)后其核酸外切酶活性可誘發(fā)mRNA降解，引起細(xì)胞凋亡。但是該蛋白對(duì)凋亡相關(guān)mRNA的調(diào)控在缺血性心肌病中是否發(fā)揮作用尚未見報(bào)道。

本研究通過敲低HL-1心肌細(xì)胞的PNPT1基因，以氧糖剝奪（OGD）模擬體內(nèi)心肌缺血損傷環(huán)境，進(jìn)而探討抑制PNPT1對(duì)OGD誘導(dǎo)的HL-1心肌細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制，以期為IHD治療的抗細(xì)胞凋亡策略提供新的干預(yù)靶點(diǎn)。

第一類“根據(jù)材料回答”類，我一般會(huì)告訴學(xué)生答案就來自材料，要求學(xué)生分析材料，找出試題設(shè)問與材料中一致的內(nèi)容。如2009年安徽省高考卷第36題第一問：依據(jù)材料一指出南宋和清朝前期外貿(mào)機(jī)構(gòu)的名稱。通過閱讀材料可以很容易得到答案：廣南市舶（即市舶使），得居停十三行（即十三行）。這類題型比較容易做答，但是許多同學(xué)都會(huì)犯同一個(gè)錯(cuò)誤，就是照抄材料，這樣答題在高考中是規(guī)定不給分的，所以學(xué)生要注意一定不要照抄材料的原文。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

HL-1細(xì)胞（小鼠心房肌細(xì)胞）（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 主要試劑

1.3.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按6×10/孔細(xì)胞接種于96孔板，過夜貼壁后，對(duì)照組置于5%CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同OGD時(shí)間處理后，各組細(xì)胞按CCK-8 試劑盒說明書，加入CCK-8反應(yīng)液，于37 ℃孵箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值。

1.3.9 透射電鏡觀察線粒體形態(tài) 0.25%胰酶消化收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，PBS液沖洗2次，之后向細(xì)胞內(nèi)加入3%戊二醛，固定1 h，PBS液沖洗2次，再向細(xì)胞內(nèi)添加1%鋨酸固定1 h，丙酮酸梯度脫水；包埋，超薄切片，鈾鉛雙染色；透射電子顯微鏡拍片。

1.3 主要方法

1.3.5 qPCR 檢測(cè)ACTB mRNA、TUBA mRNA 水平按照RNA 提取試劑盒說明書提取HL-1 細(xì)胞的總RNA。標(biāo)準(zhǔn)化各組RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行擴(kuò)增，以7SL為內(nèi)參照，用2法計(jì)算ACTB mRNA以及TUBA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。ACTB的上游引物序列為：5'-AAG GCC AAC CGC GAG AAG AT-3'，下游引物序列為：5'-ACA GCC TGG ATA GCA ACG TAC A-3'；TUBA 的上游引物為：5'-TCT GTG AAA CTG GTG CTG GA-3'；下游引物序列為：5'-AGT GAC CAC GGG CAT AGT TGT T-3'；7SL的上游引物序列為：5'-ATC GGGTGT CCG CAC TAA GTT-3'，下游引物序列為：5'-CAG CAC GGG AGT TTT GAC CT-3'。

若塊內(nèi)的灰度值大于閾值T，則把該點(diǎn)的值置為1，否則將該點(diǎn)的值置為0，將圖像二值化能更進(jìn)一步減少圖像中的信息量，減少無關(guān)信息的干擾。將灰度圖像二值化后結(jié)果見圖2。

1.3.2 OGD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒?根據(jù)參考文獻(xiàn)［5］的方法，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-1細(xì)胞接種于60 mm培養(yǎng)皿中，于第2天將已貼壁細(xì)胞更換為無糖無血清培養(yǎng)基并置于缺氧培養(yǎng)箱中（1%O、94%N、5%CO、37 ℃），按照實(shí)驗(yàn)需求培養(yǎng)不同時(shí)間后用于隨后的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下分組：正常組（Control）、氧糖剝奪組（OGD）、NC-siRNA組（轉(zhuǎn)染亂碼RNA）、PNPT1-siRNA 組、OGD+NCsiRNA組和OGD+PNPT1-siRNA組。

MEM 培養(yǎng)基（Procell）；胎牛血清（Gibco）；0.25%胰蛋白酶（Gibco）；RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR(TaKaRa)；qPCR引物由成都擎科偉業(yè)生物科技有限公司合成；PNPT1 抗體（Proteintech）；PNPT1 siRNA三條序列和對(duì)照序列由成都擎科偉業(yè)生物科技有限公司合成；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)；ɑ-Tubulin抗體（Affinity）；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（Solarbio）；JC-1 試劑盒（Solarbio）；山羊抗兔II 抗（Solarbio）；ECL發(fā)光液（Millipore）。

1.3.4 細(xì)胞PNPT1 siRNA轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞懸液置于孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至約40%密度時(shí)，按照試劑使用說明用Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑以50 nmol/L濃度進(jìn)行PNPT1 siRNA轉(zhuǎn)染或?qū)φ蛰d體轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3.1 HL-1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠HL-1細(xì)胞的培養(yǎng)基成分：10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的MEM培養(yǎng)基，置于5%CO、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。隨后每2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至約90%時(shí)，用0.25%胰酶消化后按照1∶3傳代培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞PNPT1的表達(dá) 按照蛋白提取說明書提取HL-1細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量法測(cè)定各組蛋白濃度。按20 μg總蛋白量上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5% BSA中室溫封閉1.5 h。加入相應(yīng)的I抗（PNPT1按1∶2000稀釋），4 ℃搖床孵育過夜。次日回收I抗，TBST洗膜3次，10 min/次，加入II抗（1∶5000）室溫孵育1 h。再次TBST洗膜，與ECL發(fā)光液充分反應(yīng)后掃描顯影。Image J軟件分析結(jié)果。

qPCR結(jié)果顯示，OGD誘導(dǎo)引起了ACTB和TUBA mRNA的降解（圖4A、C，＜0.05）。利用siRNA敲減PNPT1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)與NC-siRNA+OGD組相比，siRNA1+OGD組ACTB 和TUBA mRNA降解被抑制（圖4B、D，＜0.05）。

1.3.8 JC-1檢測(cè)線粒體膜電位 將各組細(xì)胞用胰酶消化，PBS重懸，2000 r/min下離心5 min，重懸于500μL細(xì)胞培養(yǎng)液中；按照J(rèn)C-1線粒體膜電位水平檢測(cè)試劑盒說明書，制備反應(yīng)緩沖液備用，吸取500μL的JC-1工作液將細(xì)胞均勻懸浮，置于培養(yǎng)箱內(nèi)20 min，取出細(xì)胞，2000 r/min離心5 min，加入稀釋好的反應(yīng)緩沖液洗滌2次，再用500μL JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。

市盈率(PE)：是最常用來估計(jì)股價(jià)水平是否合理的指標(biāo)之一。投資股票是對(duì)上市公司未來發(fā)展的一種展望，如果某股票具有較高的市盈率，代表市場(chǎng)預(yù)測(cè)未來的盈利增長(zhǎng)速度快，說明投資者情緒高昂，該股票被追捧。反之，如果整體市盈率偏低，說明投資者興趣不高。

周期分割后，每個(gè)脈搏波持續(xù)時(shí)間較短，可視單個(gè)脈搏波的基線漂移是沿一條直線產(chǎn)生的。在單個(gè)脈搏波信號(hào)中，本文令基線漂移方程為y(n)=an+b，n為樣本編號(hào)；a、b表示系數(shù)，其可通過該脈搏波的A點(diǎn)和E點(diǎn)求出。令A(yù)點(diǎn)和E點(diǎn)坐標(biāo)分別為(x1,y1)和，則基線漂移方程為。再令單個(gè)脈搏波信號(hào)序列為Pr(n)，將Pr(n)減去y(n)的對(duì)應(yīng)項(xiàng)，得到基線校準(zhǔn)后的序列Po(n)，如式（3）所示。式中i=0,1,···,N-1，N表示當(dāng)前脈搏波的樣本數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

寶寶總有一天是要自立于社會(huì)的，如果能從小培養(yǎng)寶寶自己的事情自己做、自己的東西自己管、自己的生活自己安排的“自我管理”習(xí)慣，就能增強(qiáng)寶寶行動(dòng)的獨(dú)立性、目的性和計(jì)劃性。這對(duì)于寶寶今后生活的幸福和成功無疑是有巨大的幫助的。

2 結(jié)果

2.1 OGD誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞凋亡損傷

引入siRNA在OGD條件下敲減PNPT1表達(dá)，敲減效率驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示PNPT1-siRNA1效率最高（圖3A，＜0.05），且siRNA敲減可以有效降低胞質(zhì)PNPT1蛋白含量。敲減PNPT1后，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HL-1心肌細(xì)胞OGD誘導(dǎo)下的凋亡情況，結(jié)果顯示，未予以O(shè)GD誘導(dǎo)時(shí)PNPT1敲減未明顯影響HL-1心肌細(xì)胞凋亡，而予以O(shè)GD誘導(dǎo)后PNPT1敲減明顯降低了細(xì)胞凋亡水平（圖3B，＜0.05）。

2.2 OGD誘導(dǎo)增加HL-1心肌細(xì)胞胞質(zhì)PNPT1含量

Western blot結(jié)果顯示，隨著OGD誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，HL-1心肌細(xì)胞胞質(zhì)中PNPT1的蛋白水平呈上升趨勢(shì)，且在誘導(dǎo)16 h節(jié)點(diǎn)PNPT1蛋白水平最高，這與OGD誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞凋亡的趨勢(shì)一致（圖2，＜0.05）。

2.3 PNPT1敲低減輕OGD 誘導(dǎo)的HL-1心肌細(xì)胞凋亡

給予HL-1心肌細(xì)胞不同時(shí)間梯度OGD誘導(dǎo)后，利用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，隨著OGD誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，HL-1心肌細(xì)胞存活率呈下降趨勢(shì)（圖1A，＜0.05），OGD誘導(dǎo)16 h心肌細(xì)胞存活率最低。在16 h誘導(dǎo)節(jié)點(diǎn)檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率顯示細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡（圖1B，＜0.05）。

2.4 PNPT1敲低減少OGD條件下凋亡相關(guān)mRNA降解

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將HL-1細(xì)胞按1×10/孔接種于6孔板中，貼壁后更換為無雙抗培養(yǎng)液，同時(shí)加入PNPT1-siRNA1或NC-siRNA處理24 h后再OGD處理16 h，收集上清，用不含EDTA的0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，PBS洗滌3次。按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書進(jìn)行染色，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。Flow Jo軟件分析結(jié)果。

2.5 PNPT1敲低減輕HL-1心肌細(xì)胞OGD下線粒體損傷

利用JC-1檢測(cè)線粒體膜電位，結(jié)果顯示OGD可誘導(dǎo)線粒體膜電位下降，而敲減PNPT1后OGD誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降得到部分逆轉(zhuǎn)（圖5A，＜0.05）。透射電鏡結(jié)果顯示，OGD誘導(dǎo)后線粒體形態(tài)發(fā)生明顯變化，整體呈腫脹狀態(tài)，內(nèi)部電子密度降低，嵴消失，形成空泡結(jié)構(gòu)；PNPT1敲減后線粒體形態(tài)得到明顯改善，整體腫脹程度降低，內(nèi)部可見完整的嵴結(jié)構(gòu)（圖5B）。

3 討論

在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊等病理因素作用下，IHD患者心臟冠狀動(dòng)脈血流被限制，心肌處于慢性缺血條件下，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡，纖維組織增生，引起心肌重構(gòu)，心臟功能降低和心律失常，甚至誘發(fā)死亡。研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死后梗死周圍的區(qū)域有顯著的心肌細(xì)胞凋亡，而且患者在急性心肌梗死后出現(xiàn)癥狀性心力衰竭與細(xì)胞凋亡率顯著增加相關(guān)。因此，抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞數(shù)量損失被認(rèn)為是預(yù)防IHD患者心臟損傷的重要策略，靶向mRNA治療凋亡相關(guān)疾病及心血管疾病也是目前的研究熱點(diǎn)。本研究聚焦于mRNA降解介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的新視角，基于OGD誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞構(gòu)建的體外缺血模型，利用基因敲減技術(shù)探索了PNPT1介導(dǎo)的mRNA降解在心肌細(xì)胞缺血凋亡中的重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)OGD下HL-1心肌細(xì)胞中PNPT1異常蓄積于細(xì)胞質(zhì)，并引起mRNA降解和線粒體損傷；而敲減PNPT1后OGD誘導(dǎo)的mRNA降解、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡均得到逆轉(zhuǎn)。

我國會(huì)計(jì)法律法規(guī)對(duì)會(huì)計(jì)人員的職業(yè)行為和專業(yè)素質(zhì)提出了更高要求，國家關(guān)于會(huì)計(jì)工作的相關(guān)法律法規(guī)，職業(yè)道德要求是每一名會(huì)計(jì)人員在日常工作中必須遵守的規(guī)范。通過對(duì)會(huì)計(jì)人員繼續(xù)教育培訓(xùn)，確保會(huì)計(jì)隊(duì)伍全面掌握最新的法律法規(guī)，以及對(duì)會(huì)計(jì)人員工作行為的要求。在全新的歷史時(shí)期，我們應(yīng)該充分認(rèn)識(shí)到會(huì)計(jì)人員繼續(xù)教育也是國家法律法規(guī)管理工作提出的新要求，是加強(qiáng)會(huì)計(jì)隊(duì)伍有效管理的重要組成部分，更是加強(qiáng)會(huì)計(jì)人才隊(duì)伍建設(shè)的重要內(nèi)容。開展會(huì)計(jì)人員繼續(xù)教育培訓(xùn)的目的是為了提高會(huì)計(jì)人員的政治素養(yǎng)、業(yè)務(wù)能力、職業(yè)道德水平，使其及時(shí)更新專業(yè)知識(shí)，補(bǔ)充和拓展專業(yè)素質(zhì)。

mRNA代謝正常對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要。作為蛋白合成模板，mRNA決定基因表達(dá)蛋白產(chǎn)物的最終氨基酸序列，一旦蛋白合成障礙，細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能將遭到破壞。而在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中，mRNA的降解是必不可少的，其作用在于消除產(chǎn)生異常蛋白質(zhì)的缺陷mRNA、終止該核糖核苷酸的循環(huán)和適應(yīng)環(huán)境的變化。既往研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中mRNA和rRNA在早期凋亡反應(yīng)中就發(fā)生降解，甚至早于DNA片段裂解。這一現(xiàn)象也在經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑中得到證實(shí)，在細(xì)胞凋亡早期就觀察到廣泛的mRNA 降解，并以ACTBTUBA等為代表的管家基因降解最為顯著。顯然，mRNA降解是細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但其作用揭示較為局限，是否介導(dǎo)心肌細(xì)胞缺血性凋亡也尚不清楚。本研究以管家基因ACTB 和TUBA mRNA作為觀察窗口，發(fā)現(xiàn)OGD誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞凋亡伴隨mRNA降解增加，證實(shí)mRNA降解同樣在心肌細(xì)胞缺血凋亡中發(fā)揮重要作用。

作為觸發(fā)mRNA凋亡的核酸外切酶，PNPT1的酶活性發(fā)揮決定于其亞細(xì)胞定位。既往研究提示，HCT 116細(xì)胞中PNPT1細(xì)胞質(zhì)異常蓄積誘發(fā)了廣泛mRNA降解和細(xì)胞凋亡；而干預(yù)胞質(zhì)中PNPT1水平可顯著逆轉(zhuǎn)這一過程。實(shí)際上PNPT1的生物學(xué)功能十分復(fù)雜，它既能促進(jìn)某些mRNA的降解也在一部分mRNA的穩(wěn)定維持中發(fā)揮作用。有研究在黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)PNPT1后發(fā)現(xiàn)，PNPT1通過激活PKR-EIF2α通路進(jìn)而下調(diào)抗凋亡蛋白BCL-X表達(dá)最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，PNPT1還被證實(shí)通過降解原癌基因cmyc的mRNA使細(xì)胞周期停滯在G1期，導(dǎo)致細(xì)胞S期縮短而發(fā)生凋亡。本研究揭示了PNPT1在心肌細(xì)胞缺血凋亡中的重要作用，發(fā)現(xiàn)OGD下PNPT1異常蓄積于HL-1心肌細(xì)胞胞質(zhì)并誘導(dǎo)mRNA降解及線粒體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究基于OGD誘導(dǎo)HL-1心肌細(xì)胞構(gòu)建的體外心肌缺血模型，初步揭示了PNPT1 介導(dǎo)的mRNA降解在心肌細(xì)胞缺血性凋亡中的重要作用。心房肌細(xì)胞缺血性凋亡一直被認(rèn)為是缺血性心肌病心房重構(gòu)的細(xì)胞基礎(chǔ)，心房肌細(xì)胞丟失誘發(fā)的纖維化增生也是導(dǎo)致AF等心律失常的主要機(jī)制。我們?cè)谂c人原代心房肌細(xì)胞具有相似分子反應(yīng)的HL-1心肌細(xì)胞上驗(yàn)證的介導(dǎo)細(xì)胞缺血性凋亡的新機(jī)制將為缺血性心肌病的抗凋亡靶點(diǎn)開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。此外，我們進(jìn)一步揭示了PNPT1介導(dǎo)mRNA降解對(duì)線粒體的損傷效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提示了mRNA降解在心肌細(xì)胞缺血性凋亡中的上游調(diào)控地位。