繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)（SHPT)的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確，目前認(rèn)為是由活性維生素D受體表達(dá)降低、血鈣降低，血磷升高和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23升高與PTH升高等多因素相互作用的結(jié)果。SHPT是慢性腎臟?。–KD）患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，CKD是一個(gè)重大的全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)人們疾病的發(fā)病率和死亡率具有很大的影響，其最嚴(yán)重的全身性問(wèn)題與礦物質(zhì)和激素的失衡有關(guān)，這些失衡會(huì)導(dǎo)致SHPT并伴有甲狀旁腺(PTG)增生。CKD中的SHPT與腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良、骨外鈣化、骨礦化受損和心血管疾病有關(guān)，SHPT加劇的礦物質(zhì)代謝紊亂和心腦血管紊亂均是CKD患者死亡的主要原因。目前針對(duì)以上機(jī)制，早期SHPT的治療主要包括維生素D受體激動(dòng)劑、擬鈣劑和磷酸鹽粘合劑等藥物治療，然而，對(duì)于晚期SHPT患者，因藥物治療效果甚微或不能耐受手術(shù)治療等原因，嚴(yán)重影響了SHPT的生存，因此，加強(qiáng)SHPT發(fā)病機(jī)制的研究對(duì)于延緩疾病進(jìn)展和尋找治療疾病的新方案具有重要的科學(xué)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景。

維生素D受體（VDR）是一種類(lèi)固醇激素受體，能調(diào)節(jié)許多生理過(guò)程，當(dāng)VDR活性失調(diào)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致多種疾病。VDR主要通過(guò)與活性維生素D結(jié)合產(chǎn)生大部分生物學(xué)效應(yīng)，然后發(fā)揮其作用。在慢性腎臟病并發(fā)SHPT的過(guò)程中，甲狀旁腺組織從代償性增生發(fā)展為結(jié)節(jié)狀或瘤樣增生，導(dǎo)致了甲狀旁腺細(xì)胞鈣敏感受體、VDR、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1和Klotho表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步使得PTH分泌增加和促進(jìn)甲狀旁腺細(xì)胞的增殖失控，從而導(dǎo)致SHPT 進(jìn)一步加重。然而，VDR 在SHPT中下調(diào)的具體機(jī)制尚不清楚。miRNA是轉(zhuǎn)錄后水平上基因表達(dá)調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子，參與各種正常生理過(guò)程，而miRNA失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)胞功能的受損和疾病進(jìn)展。有學(xué)者曾提出，甲狀旁腺miRNA對(duì)于SHPT的發(fā)展是必不可少的，同時(shí)可調(diào)節(jié)PTH的分泌。然而miRNA 在SHPT 中的作用尚未被廣泛研究且其在SHPT中調(diào)節(jié)的證據(jù)非常有限。甲狀旁腺的miRNA在甲狀旁腺分泌、基因表達(dá)和甲狀旁腺細(xì)胞增殖水平上對(duì)甲狀旁腺功能的激活至關(guān)重要。有研究表明甲狀旁腺miRNA在慢性低鈣血癥和尿毒癥SHPT的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Shilo等研究結(jié)果提示某些特異性miRNA的下調(diào)影響體內(nèi)和體外的PTH分泌。由此可見(jiàn)，在未來(lái)的研究可能將miRNA作為SHPT治療的新靶點(diǎn)。miRNA通過(guò)靶向下游分子從而對(duì)疾病造成影響的研究已在多種疾病中得到證實(shí)，但在SHPT中還暫未得到證實(shí)。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制被證明在許多疾病中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用，為了揭示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子機(jī)制是否在SHPT中發(fā)揮同樣重要的作用，我們?cè)噲D明確miRNA是否能夠調(diào)控VDR，miRNA是否通過(guò)調(diào)控VDR參與了SHPT的發(fā)生發(fā)展，這將為尋找靶向治療SHPT提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

SHPT的甲狀旁腺原代細(xì)胞為收取SHPT患者的甲狀旁腺組織標(biāo)本（經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院病理科證實(shí)為甲狀旁腺），利用膠原酶消化法提取獲得，用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)；正常的甲狀腺旁腺組織來(lái)源于甲狀腺癌需行淋巴結(jié)清掃的患者手術(shù)中誤切的正常甲狀旁腺組織共6例（術(shù)后經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院病理科證實(shí)為甲狀旁腺），293T細(xì)胞（上海中喬新舟生物科技有限公司）用于雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)。人VDR 基因3'UTR 報(bào)告載體psiCHECK-2-VDR（長(zhǎng)沙艾碧維生物科技有限公司）；Lipofectamine3000 Reagent、Trziol Reagent（Invitrogen）；VDR 抗體（CST），PTH 抗體（Bioss），GAPDH 抗體（Proteintech）；Dual Luciferase Reporter Assay Kit（南京維諾贊生物科技有限公司）；miRNA mimics、miRNA inhibitor、miRNA NC、miRNA qRT-PCR Starter Kit、mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit、riboFECTCP Reagent及miRNA、mRNA引物（銳博生物）；免疫熒光染色試劑盒（凱基生物）；免疫組化抗原修復(fù)緩沖液、通用二步法試劑盒（小鼠/兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）（中杉金橋）。標(biāo)本的獲取經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（No:2020-S574）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 利用膠原酶消化法，將手術(shù)切除的SHPT患者的甲狀旁腺剪碎后放置在1%的膠原酶中、置于37 ℃、5%CO的恒溫培養(yǎng)箱中消化1 h，期間每隔10 min用巴氏管吹打數(shù)次，將過(guò)篩后的懸液離心（1000 r/min，5 min），離心后棄上清，用RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸離心后的沉淀，將懸液轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶后放在37 ℃、5%CO的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)收集上清并換液，293Tcell在含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

適于微電網(wǎng)可控開(kāi)關(guān)無(wú)縫切換的無(wú)源網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化設(shè)計(jì)//侯靈犀,徐琳,魏應(yīng)冬,姜齊榮,丁理杰,林瑞星//(7):171

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 利用miR表達(dá)載體psiCHECK-2構(gòu)建psiCHECK-2-VDR對(duì)應(yīng)miRNA質(zhì)粒，將預(yù)測(cè)得到VDR3’UTR 與miRNA 的結(jié)合位點(diǎn)插入該載體中。293T 細(xì)胞接種培養(yǎng)于24 孔板中，次日，按照Lipofectamine3000 Reagent說(shuō)明書(shū)，用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基和Lipo3000 Reagent稀釋miRNA mimics制備成m,用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基和P3000 reagent稀釋對(duì)應(yīng)質(zhì)粒制備成m，將m、m混勻后靜置15 min后加入各對(duì)應(yīng)培養(yǎng)有293T細(xì)胞的24孔板中，72 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 將按照上述方法進(jìn)行質(zhì)粒和miRNA mimics共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞收集，用細(xì)胞裂解液裂解5 min，離心（12 000 g，2 min）后取上清備用，分別向96孔板中加入Luciferase Substrate后再取上述上清加入，讀數(shù)，再向每孔中加入Renilla substrate工作液后再次讀數(shù)。得到結(jié)果將海參熒光比上螢火蟲(chóng)熒光，并將結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1984年的大洋國(guó)就像是邊沁筆下的一座全景敞視監(jiān)獄：“老大哥”是坐在中心瞭望塔中的監(jiān)督者，各個(gè)部門(mén)的官員和所有無(wú)產(chǎn)者則是每一個(gè)囚室中的被監(jiān)禁者。這座“監(jiān)獄”能夠通過(guò)電子屏幕、竊聽(tīng)器、思想警察等聽(tīng)到看到人們的一切聲音和舉止，但是他們不知道自己是否正在被監(jiān)視以及何時(shí)被監(jiān)視。

從形態(tài)學(xué)觀察剛提取種下的原代細(xì)胞散在分布，呈圓形，后細(xì)胞慢慢生長(zhǎng)為呈多角形或梭形，傳代后細(xì)胞以梭形為主且生長(zhǎng)緩慢；培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)其PTH的分泌，可見(jiàn)P0及P1代原代細(xì)胞的PTH分泌相對(duì)穩(wěn)定，P2代PTH分泌下降明顯；將P1代原代細(xì)胞進(jìn)行針對(duì)PTH抗體的免疫熒光染色，可見(jiàn)熒光二抗標(biāo)記的PTH抗體顯示綠色熒光，細(xì)胞核顯示藍(lán)色熒光（圖1）。

1.2.4 甲狀旁腺原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 利用riboFECTCP Reagent將miRNA mimics、miRNA inhibitor轉(zhuǎn)染SHPT的甲狀旁腺原代細(xì)胞，首先用riboFECTCP Buffer稀釋miRNA mimics/miRNA inhibitor，再向上述稀釋液中加入riboFECTCP Reagent，靜置15 min后分別加入對(duì)應(yīng)6孔板每孔中，96 h后收集細(xì)胞。

公司秉承南粵大地勇于創(chuàng)新、敢于開(kāi)拓的改革精神，不斷完善體系管理，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模，提高產(chǎn)品質(zhì)量，以“天道酬勤，厚德載物”為理念，向著“管連中國(guó)，道通全球”的目標(biāo)不斷邁進(jìn)。

過(guò)表達(dá)hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-93-3p與相應(yīng)的組比較，VDR mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；過(guò)表達(dá)hsa-miR-301a-5p，VDR mRNA水平增加（=0.0349，圖3）。抑 制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p與相應(yīng)組比較，VDR mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05，圖4）。過(guò)表達(dá)hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p與相應(yīng)組比較，VDR 蛋白表達(dá)均下降，其中以hsa-miR-149-5p 組下降最明顯（圖5A）。抑制hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p與相應(yīng)組比較，VDR蛋白表達(dá)增加；而hsa-miR-149-5p與相應(yīng)組比較，VDR蛋白表達(dá)減弱（5B）。

SHPT的甲狀旁腺組織中hsa-miR-149-5p的表達(dá)水平明顯高于正常甲狀旁腺組織（=0.046，圖8A）；SHPT的甲狀旁腺組織的VDRmRNA水平明顯低于正常甲狀旁腺組織（=0.0267，圖8B）。應(yīng)用免疫組化檢測(cè)了VDR蛋白在SHPT甲狀旁腺組織中的表達(dá)情況，可見(jiàn)正常甲狀旁腺的免疫組織化學(xué)染色情況示幾乎所有主細(xì)胞的細(xì)胞核可見(jiàn)VDR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)，呈黃褐色，胞膜和胞漿幾乎不著色，染色為強(qiáng)陽(yáng)性（圖9A）；SHPT甲狀旁腺的免疫組織化學(xué)染色情況顯示為VDR陽(yáng)性細(xì)胞幾乎未見(jiàn)表達(dá)，可見(jiàn)染色為陰性（圖9B）。

我國(guó)于2011年開(kāi)始實(shí)施農(nóng)村土地確權(quán)登記工作，截止到目前，已經(jīng)有600多個(gè)縣市完成了土地測(cè)量工作，為了確保對(duì)土地測(cè)量成果的有效分析和管理，相關(guān)部門(mén)建立了城鄉(xiāng)一體化的數(shù)據(jù)信息庫(kù)，這不僅為不動(dòng)產(chǎn)登記管理提供了便利，同時(shí)也大大提高了數(shù)據(jù)查詢(xún)和服務(wù)的整體效率。在不動(dòng)產(chǎn)登記管理過(guò)程中，由于新建房屋產(chǎn)權(quán)必須要進(jìn)行有效登記和管理，所以不動(dòng)產(chǎn)測(cè)繪工作重要性不言而喻。截止到目前，我國(guó)一共進(jìn)行了2次大規(guī)模的房產(chǎn)普查，并且建立了有效的數(shù)據(jù)信息庫(kù)，但是仍然有一些老舊房產(chǎn)沒(méi)有得到登記和管理，同時(shí)對(duì)于一些小產(chǎn)權(quán)的房屋也沒(méi)有實(shí)現(xiàn)登記，這就給不動(dòng)產(chǎn)登記管理造成了嚴(yán)重的困擾，同時(shí)也制約了我國(guó)城市化建設(shè)的進(jìn)一步實(shí)施。

1.2.8 免疫組織化學(xué) 將石蠟切片浸泡在松節(jié)油中脫蠟，分別在無(wú)水乙醇中浸泡10 min，95%乙醇浸泡3 min，75%乙醇中浸泡3 min，自來(lái)水沖洗3 min，ddHO浸泡3 min，PBS泡3 min進(jìn)行水化，隨后利用高壓鍋煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，并利用內(nèi)源性過(guò)氧化酶阻斷劑阻斷過(guò)氧化酶，然后敷一抗過(guò)夜，孵二抗，利用顯色液進(jìn)行顯色，蘇木素復(fù)染，在65 ℃烤箱烤8 min脫水后封片室溫過(guò)夜，顯微鏡下觀察、拍照記錄。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad Prism 8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩獨(dú)立樣本比較采用成組檢驗(yàn)，＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SHPT的甲狀旁腺原代細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定

1.2.5 RNA提取和qRT-PCR 使用Trziol Reagent提取細(xì)胞和組織樣本的總RNA；使用miRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒對(duì)miRNA在正常甲狀旁腺和SHPT的甲狀旁腺的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；然后40個(gè)循環(huán)分別在95 ℃，2 s、60 ℃，20 s、70 ℃，10 s，最后按照機(jī)器默認(rèn)溶解曲線延伸至程序結(jié)束；使用mRNA/lncRNA qRT-PCR Starter Kit試劑盒對(duì)VDRmRNA在正常甲狀旁腺和SHPT的甲狀旁腺的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃，10 min；然后40個(gè)循環(huán)分別在95 ℃，5 s、60 ℃，30 s、72 ℃，30 s至結(jié)束。使用2方法將結(jié)果分別進(jìn)行歸一化。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，引物由廣州市銳博生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

2.2 靶向VDR的miRNA與其靶向關(guān)系的驗(yàn)證

通過(guò)生物信息學(xué)方法(http://www.targetscan.org/vert_72/)找到靶向VDR的miRNA,分別為hsa-miR-149-5p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-873-5p、hsa-miR-93-3p。構(gòu)建psiCHECK-2 載體，其分別包含了VDR與上述7個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)序列。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)hsa-miR-149-5p mimics、hsa-miR-222-3p mimics、hsa-miR-29a-5p mimics、hsa-miR-301a-5p mimics、hsa-miR-873-5p mimics、hsa-miR-93-3p mimics對(duì)插入了對(duì)應(yīng)VDR3’UTR片段的熒光素酶活性均有下降，而hsa-miR-221-5p mimics對(duì)插入了對(duì)應(yīng)VDR3'UTR片段的熒光素酶活性上升，且結(jié)合前期本課題組對(duì)部分測(cè)序得到的上調(diào)的miRNA進(jìn)行組織樣本的驗(yàn)證，后續(xù)實(shí)驗(yàn)則選取hsa-miR-149-5p mimics、hsa-miR-29a-5p mimics、hsa-miR-301a-5p mimics、hsa-miR-93-3p mimics 進(jìn)行。針對(duì)psiCHECK-2-VDR-149 質(zhì)粒進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)hsa-miR-149 mimics 對(duì)插入對(duì)應(yīng)VDR mutant 3'UTR片段的熒光素酶活性影響不明顯，同時(shí)NC組對(duì)VDR3’UTR片段的熒光素酶活性影響不明顯（圖2）。

2.3 甲狀旁腺細(xì)胞過(guò)表達(dá)和抑制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p 對(duì)VDR mRNA和蛋白水平的影響

1.2.6 蛋白的提取及Western blot 利用RIPA裂解液及PMSF組成混合液來(lái)提取細(xì)胞樣品的總蛋白，收集并測(cè)定各組樣品的蛋白質(zhì)濃度。按照說(shuō)明書(shū)配制濃縮膠和分離膠，將所需樣本煮沸后點(diǎn)樣，開(kāi)始電泳、轉(zhuǎn)膜、并采用5%脫脂牛奶于室溫封閉1 h，在4 ℃與相應(yīng)一抗孵育過(guò)夜，然后與二抗室溫孵育2 h，用ECL發(fā)光顯色，后采用Image J進(jìn)行圖像分析。

2.4 甲狀旁腺細(xì)胞分別過(guò)表達(dá)和抑制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p 對(duì)SHPT的PTH分泌的影響

甲狀旁腺細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加PTH可先有增加趨勢(shì)，但在第6天達(dá)高峰后逐漸下降（圖6）。甲狀旁腺細(xì)胞過(guò)表達(dá)和抑制hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-3p后對(duì)上清PTH 分泌的影響，從圖中可發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hsa-miR-149-5p、hsa-miR-301a-5p PTH分泌增加（圖7）。

2.5 hsa-miR149-5p與VDR在SHPT的甲狀旁腺組織標(biāo)本中的表達(dá)

1.2.7 細(xì)胞免疫熒光 將傳代后爬片后的原代細(xì)胞用4%多聚甲醛固定液固定，洗凈然后用封閉液進(jìn)行封閉，并在搖床上固定1 h，洗凈后在玻片上滴加稀釋好的一抗4 ℃過(guò)夜，第2天去除一抗并洗凈，滴加適量熒光標(biāo)記的二抗避光室溫?fù)u床孵育1 h，洗凈后用DAPI進(jìn)行核染10 min后封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

3 討論

3.1 SHPT的甲狀旁腺原代細(xì)胞體外培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)的可行性

細(xì)胞培養(yǎng)一直以來(lái)是生物醫(yī)學(xué)和臨床前研究的基礎(chǔ)，對(duì)于大多數(shù)腫瘤疾病和常見(jiàn)疾病的研究我們都可以得到相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，關(guān)于甲狀旁腺的細(xì)胞系的研究并不成熟，而我們成功利用膠原酶消化法從SHPT患者手術(shù)切除的甲狀旁腺組織提取得到甲狀旁腺原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其形態(tài)與既往研究中所培養(yǎng)的甲狀旁腺原代細(xì)胞大致相似，PTH免疫熒光染色顯示陽(yáng)性，同樣可證明我們按前方法所提取的細(xì)胞是甲狀旁腺原代細(xì)胞。我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)自己提取并培養(yǎng)的甲狀旁腺原代細(xì)胞進(jìn)行了相應(yīng)的功能實(shí)驗(yàn)，是其他研究中未曾涉及的。研究表明腫瘤組織的原代細(xì)胞可以表現(xiàn)出與原發(fā)腫瘤相同的特性，且由此建立的一些細(xì)胞模型被證明是研究腫瘤形態(tài)和生物學(xué)的良好平臺(tái)，可見(jiàn)培養(yǎng)原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是可取的。

在電力行業(yè)的市場(chǎng)化運(yùn)營(yíng)中，市場(chǎng)需求的不確定性和風(fēng)險(xiǎn)偏好直接影響到購(gòu)電商的決策。研究基于用電戶隨機(jī)需求構(gòu)建購(gòu)電商決策模型，用前景理論刻畫(huà)購(gòu)電商的風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避度，為購(gòu)電商提供最優(yōu)決策。結(jié)論表明購(gòu)電商最優(yōu)購(gòu)電量隨市場(chǎng)風(fēng)險(xiǎn)或零售價(jià)格的增大而增大；購(gòu)電商最優(yōu)購(gòu)電量隨購(gòu)電商風(fēng)險(xiǎn)規(guī)避度、批發(fā)價(jià)格或銷(xiāo)售變動(dòng)成本增大而減少。以上結(jié)論為電力體制改制背景下的電力企業(yè)最優(yōu)決策提供了理論參考。

3.2 VDR基因表達(dá)降低在SHPT中起著重要作用

SHPT一直與甲狀旁腺VDR表達(dá)降低有著重要關(guān)系，有研究利用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者甲狀旁腺組織VDR的密度顯著下降且與增殖細(xì)胞核抗原呈負(fù)相關(guān)，另一項(xiàng)研究中利用RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VDRmRNA 的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)在甲狀旁腺腺瘤和SHPT的甲狀旁腺組織中其表達(dá)水平均較正常甲狀旁腺下降，我們的研究與上述研究中SHPT中VDR表達(dá)降低一致。既往研究只證明了增生和甲狀旁腺VDR表達(dá)之間的相關(guān)性，VDR表達(dá)減少是否為甲狀旁腺增生的原因還不清楚。另外有研究發(fā)現(xiàn)SHPT發(fā)生的變異性可能與遺傳異質(zhì)性有關(guān)，其中影響PTH分泌的最佳候選基因是VDR基因，但是其影響PTH分泌的具體機(jī)制不明確。VDR蛋白表達(dá)降低似乎是SHPT的一種特征性致病機(jī)制，但是其表達(dá)降低的具體機(jī)制尚不清楚。因此我們的研究進(jìn)一步通過(guò)對(duì)靶向VDR 3’UTR的miRNA的篩選，發(fā)現(xiàn)VDR下調(diào)的機(jī)制可能與SHPT中hsa-miR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-93-5p 的高表達(dá)存在關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)這些miRNA的過(guò)表達(dá)會(huì)使VDR基因下調(diào)從而導(dǎo)致PTH的分泌增加，考慮在SHPT中VDR的下調(diào)和導(dǎo)致PTH分泌增加的機(jī)制可能與miRNA的過(guò)表達(dá)有關(guān)。

本文先對(duì)我國(guó)目前地理信息資源成果管理的現(xiàn)狀進(jìn)行了分析，在對(duì)地理信息成果進(jìn)行管理時(shí)，以數(shù)據(jù)庫(kù)與基礎(chǔ)測(cè)繪數(shù)據(jù)庫(kù)等設(shè)置為數(shù)據(jù)來(lái)源，并以數(shù)據(jù)中心為基礎(chǔ)利用數(shù)據(jù)倉(cāng)庫(kù)的方法對(duì)地理信息數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)一的管理，在大數(shù)據(jù)時(shí)代對(duì)多樣化數(shù)據(jù)、海量數(shù)據(jù)的管理提供了科學(xué)合理的方式，提升我國(guó)地理信息管理效率。

3.3 miRNA在SHPT中促進(jìn)PTH的分泌

Shilo 等的一項(xiàng)在小鼠中的研究證明let-7、miR148對(duì)PTH分泌有著一定的作用。Jeong等的研究發(fā)現(xiàn)與miR-3680-5p相關(guān)的靶基因所參與得泛素蛋白水解途徑在PTH和PTH相關(guān)蛋白的降解和蛋白水解中起作用。在最近的一項(xiàng)研究中，發(fā)現(xiàn)在CKD的SHPT小鼠的甲狀旁腺中，miR-129可以負(fù)向調(diào)節(jié)促增殖、促PTH誘導(dǎo)的FGF23/αKlotho信號(hào)。上述研究都提示miRNA在SHPT中對(duì)PTH的分泌有一定影響，但是其具體機(jī)制尚未明確。在我們的研究中同樣也證明了miRNA在SHPT中影響PTH分泌，而且我們通過(guò)在人的SHPT 的甲狀旁腺原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制hsamiR-149-5p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsamiR-93-5p，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)hsa-miR-149-5p、hsamiR-301a-5p后可促進(jìn)PTH的分泌，抑制上述miRNA后對(duì)PTH 分泌并無(wú)明顯的抑制作用。由此可見(jiàn)hsamiR-149-5p、hsa-miR-301a-5p在SHPT中可能主要通過(guò)下調(diào)VDR基因的表達(dá)促進(jìn)SHPT患者PTH的分泌。

3.4 miRNA通過(guò)靶向VDR在SHPT中其重要作用

迄今為止，已在人類(lèi)中鑒定出許多miRNA，且人類(lèi)基因中有超過(guò)三分之一是miRNA靶標(biāo)，miRNA主要通過(guò)直接使靶基因mRNA降解或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯來(lái)控制基因的表達(dá)。在miR-23、miR-351、miR-1204分別在人腹膜系膜細(xì)胞、MSC成骨分化、乳腺癌中通過(guò)作用于VDR來(lái)發(fā)揮重要作用。在卵巢癌、炎癥性腸病中也發(fā)現(xiàn)miRNA既通過(guò)直接使VDRmRNA降解又通過(guò)抑制VDR轉(zhuǎn)錄后的翻譯來(lái)控制基因的表達(dá)。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)在SHPT的甲狀旁腺原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)hsa-miR-301a-5p后使VDRmRNA表達(dá)水平增加且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與miRNA在多數(shù)情況下負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)不相符，但有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA可能可以上調(diào)靶基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用，因此考慮在SHPT中是否也存在某些miRNA通過(guò)上調(diào)靶基因來(lái)發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。在SHPT的甲狀旁腺原代細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制上述miRNA后對(duì)VDRmRNA水平、VDR蛋白表達(dá)水平及對(duì)PTH 分泌的影響說(shuō)明在SHPT 中miRNA可能只通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄后水平VDR蛋白的翻譯，而不能通過(guò)使VDRmRNA 降解來(lái)控制基因的表達(dá)，miRNA可以與靶基因互補(bǔ)結(jié)合，切斷靶基因的mRNA分子，從而影響下游基因的表達(dá)。miRNA也可以與靶基因不完全互補(bǔ)結(jié)合，進(jìn)而阻遏翻譯而不影響mRNA的穩(wěn)定性，抑制靶基因的翻譯，且在SHPT中miRNA主要通過(guò)下調(diào)VDR基因的表達(dá)來(lái)起到促進(jìn)PTH分泌的作用。由于在SHPT 中PTH 分泌的增加并不只是由于VDR基因下調(diào)這一個(gè)因素所造成，因此抑制miRNA后未能使PTH分泌降低可能是由于未能排除其他因素對(duì)PTH分泌的影響，也可能因?yàn)橐种七@些miRNA后對(duì)雖然使VDR上調(diào)，但由于患者未給予相應(yīng)與之結(jié)合后發(fā)揮功能的刺激，從而未能抑制PTH分泌，因此還需要更深入的研究。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以通過(guò)靶向VDR 基因影響PTH 分泌，這可能，為早日找到治療SHPT更好的方法提供了可能性。