哺乳動(dòng)物中雷帕鳴的靶蛋白mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化過程中高度保守，可在多種因素的活化下參與細(xì)胞的增殖、凋亡、血管生成和自噬等生物學(xué)功能。mTOR可以和不同的蛋白結(jié)合形成mTOR復(fù)合物（mTORC）。在生物體內(nèi)mTORC至少以兩種形式存在：mTORC1 和mTORC2。mTORC1 由mTOR、Raptor、FKBP12、PRAS40和mLST8等蛋白組成，對雷帕鳴敏 感，mTORC2 由mTOR、Rictor、Sin1、Protor 和mLST8等蛋白組成，對雷帕鳴不敏感。目前的研究認(rèn)為，雷帕鳴及其衍生物不能完全地抑制mTORC1的活性，對mTORC2無效，同時(shí)可反饋性地激活A(yù)KT信號，是影響其生物學(xué)作用的主要原因。因此，科學(xué)家們希望能夠研發(fā)一種既可以阻斷mTORC1 信號，同時(shí)又可以阻斷mTORC2信號的新型雙mTOR抑制劑。AZD2014 正是這類新型mTOR 抑制劑中的佼佼者。

既往研究已證實(shí)，mTOR信號通路在免疫調(diào)節(jié)中具有重要的作用，傳統(tǒng)的單mTORC1抑制劑雷帕鳴是臨床上移植術(shù)后常用的免疫抑制劑。另一方面，前期我們已經(jīng)證實(shí)雙mTOR抑制劑AZD2014對肝細(xì)胞癌具有顯著抗癌作用。而肝癌肝移植術(shù)后長期應(yīng)用免疫抑制劑理論上會增加肝癌的復(fù)發(fā)率。所以如果AZD2014同時(shí)具有抗癌作用和抗排斥作用，便可以抑制肝癌肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)的同時(shí)降低肝癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。但是雙mTORC抑制劑AZD2014是否具有抑制肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的作用尚不清楚?；谝陨显颍覀兝猛N異基因大鼠肝移植模型來驗(yàn)證雙mTORC1/2抑制劑AZD2014是否具有抑制肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的作用。

1 材料和方法

1.1 大鼠

雄性Lewis大鼠和Brown Norway (BN)大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，7～10周齡，體質(zhì)量180～220 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級，每天12 h光照/12 h黑暗的晝夜循環(huán)，動(dòng)物可自由地進(jìn)食和飲水。

1.2 主要試劑和器械

AZD2014（Selleckchem），乙醚（中國廣州市化學(xué)試劑廠），聚乙二醇（Sigma），Tween 80（Sigma），林格氏液、10%葡萄糖溶液（中國上海百特醫(yī)療用品有限公司），肝素鈉注射液（中國齊魯制藥有限公司），哌拉西林鈉/他唑巴坦（中國華北制藥股份有限公司），蘇木素、伊紅（中國谷歌生物），PV-9000通用型二步法免疫組化檢測試劑盒（中國北京中杉金橋公司），正常山羊血清封閉液（中國武漢博士德公司），大鼠CD3多克隆一抗，大鼠Foxp3多克隆一抗（中國谷歌生物）。顯微外科手術(shù)放大鏡（Leica），顯微外科直鑷、彎鑷、彎剪、持針器、血管夾（中國上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司），全自動(dòng)生化分析儀（BECKMAN），普通正置顯微鏡（OLYMPUS），生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，組織烤片機(jī)（Thermo），石蠟切片機(jī)（Leica），自動(dòng)雙重純水蒸餾器（Millipore），8-0、9-0 prolene血管縫線（愛惜康）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和建模

采用Kamada 提出的“二袖套”法建立Lewis→BN同種異基因大鼠肝移植急性排斥反應(yīng)模型。術(shù)后將BN大鼠隨機(jī)分成2組（對照組和AZD2014給藥組），4只/組。AZD2014給藥組每天腹腔內(nèi)注射AZD2014藥物，5 mg/kg體質(zhì)量，1次/d；對照組每天腹腔內(nèi)注射藥物溶劑（PBS 液含2%聚乙二醇，0.2%Tween 80，0.5%DMSO）2.5 mL/kg體質(zhì)量，1 次/d。受體BN大鼠分別于術(shù)前第3天和術(shù)后第1、3、5、7、10、14天收集血清標(biāo)本，全自動(dòng)生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和總膽紅素（TBIL）。觀察終點(diǎn)：大鼠死亡或術(shù)后生存時(shí)間≥14 d，記錄生存時(shí)間，進(jìn)行生存分析。觀察終點(diǎn)出現(xiàn)后，收集移植肝臟。移植肝臟行免疫組化檢測CD3和Foxp3的表達(dá)水平，評估移植物中T淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞浸潤的程度；移植肝臟行HE染色，采用Banff方案評估肝移植術(shù)后的排斥反應(yīng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)，所有操作符合動(dòng)物倫理要求。

對照組移植肝臟內(nèi)有大量成團(tuán)聚集的炎性細(xì)胞浸潤（圖3A）；而AZD2014組僅有少量散在的炎性細(xì)胞浸潤（圖3D）。圖3B和圖3E分別顯示對照組和AZD2014組移植肝內(nèi)一個(gè)典型的肝小葉結(jié)構(gòu)，可以看到對照組的匯管區(qū)和中央靜脈周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，而AZD2014組的匯管區(qū)和中央靜脈周圍未見明顯的炎性周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，中央靜脈周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，管腔變形，可見部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落（圖3C）。而AZD2014組的匯管區(qū)主要以少量淋巴細(xì)胞浸潤為主；中央靜脈形態(tài)正常，內(nèi)皮下未見明顯炎性細(xì)胞浸潤，周圍肝實(shí)質(zhì)有少量散在淋巴細(xì)胞浸潤（圖3F）。根據(jù)Banff方案進(jìn)行排斥反應(yīng)指數(shù)評分，結(jié)果見圖4。

1.4 蘇木素-伊紅（HE）染色

這封信后來被潘際鑾當(dāng)作鉆石婚紀(jì)念相冊的扉頁。每次翻及，潘際鑾都會大笑，而李世豫則會靦腆地低頭：“他十多歲就在炮火聲中四處逃難，后來流亡到昆明，進(jìn)了西南聯(lián)大。他知道強(qiáng)國必須強(qiáng)工業(yè)，自此就把自己同國家的命運(yùn)焊接在了一起。”

1.5 免疫組化染色

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有檢驗(yàn)方法均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，假設(shè)檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本的檢驗(yàn)。移植術(shù)后兩組間生存率的計(jì)算采用Kaplan-Meier法，兩組間生存率的比較采用log-rank法。兩組間不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)測量的數(shù)據(jù)采用兩個(gè)重復(fù)測量因素的方差分析。

術(shù)后第1天，對照組和AZD2014組中血清ALT和AST均較術(shù)前顯著升高（圖2A、B）。術(shù)后第3天，對照組血清ALT和AST水平略有下降，但之后又迅速進(jìn)行性地升高，并維持在高水平狀態(tài)（圖2A、B）；而在AZD2014組中，術(shù)后3 d內(nèi)血清ALT和AST迅速下降，并持續(xù)維持在低水平狀態(tài)（圖2A、B）。對照組中的血清TBIL在術(shù)后前5日維持在低水平狀態(tài)，但從術(shù)后第5天開始迅速進(jìn)行性升高，并維持在高水平狀態(tài)（圖2C）；而AZD2014組中的血清TBIL始終維持在低水平狀態(tài)（圖2C）。因此，從肝損傷的角度來看，AZD2014可以顯著減輕同種異基因大鼠肝移植術(shù)后肝細(xì)胞的損害（＜0.05）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

按1.4所述方法準(zhǔn)備組織切片；采用高壓法修復(fù)組織抗原；3%的HO溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶；山羊血清封閉溶液，室溫下封閉20 min；滴加少許（以能覆蓋組織切片為準(zhǔn)）相關(guān)抗體（抗體的稀釋比例以各自說明書以準(zhǔn)），4 ℃冰箱中孵育過夜；次晨，切片復(fù)溫后，從PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒中取出試劑1（增強(qiáng)劑），滴加少許，室溫下孵育20 min；再從PV-9000二步法免疫組化檢測試劑盒中取出試劑2（通用型抗鼠/免二抗），滴加少許，室溫下孵育30 min；DAB顯色液顯色；蘇木素染色后，將組織切片置于梯度酒精中脫水，酒精濃度依次為75%、85%、95%、100%(I)、100%(II)，每梯度脫水5 min；二甲苯透明及封片。

2 結(jié)果

2.1 AZD2014對肝移植術(shù)后2周內(nèi)大鼠生存率的影響

術(shù)后1周內(nèi)，兩組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)能力和對外界刺激的反應(yīng)無明顯差別。對照組在術(shù)后第8天，開始出現(xiàn)毛發(fā)蓬松，精神狀態(tài)、活動(dòng)能力和對外界刺激反應(yīng)下降的現(xiàn)象，術(shù)后第9天開始有大鼠死亡，術(shù)后14 d內(nèi)有3/4 的大鼠死亡；而AZD2014組在整個(gè)觀察期（14 d）內(nèi)大鼠的精神狀態(tài)和活動(dòng)能力良好，對外界刺激反應(yīng)靈敏，但進(jìn)食量較正常大鼠下降（可能與藥物的副作用有關(guān)），術(shù)后14 d內(nèi)4/4大鼠存活。肝移植術(shù)后兩組大鼠術(shù)后生存分析見圖1（χ=4.213，=0.040）。細(xì)胞浸潤。對肝小葉結(jié)構(gòu)進(jìn)一步放大，發(fā)現(xiàn)對照組的匯管區(qū)內(nèi)呈混合炎性細(xì)胞浸潤，包括嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，并且炎癥向周圍肝實(shí)質(zhì)擴(kuò)散；小葉間膽管周圍有大量炎性細(xì)胞浸潤，炎性細(xì)胞侵入膽管基底膜內(nèi)側(cè)，部分膽管上皮細(xì)胞出現(xiàn)核旁空泡變性，部分膽管上皮細(xì)胞排列紊亂；小葉間靜脈

2.2 AZD2014對肝移植術(shù)后大鼠ALT、AST和TBIL的影響

高中化學(xué)的主要研究內(nèi)容是從微觀的角度研究物質(zhì)的成分、性質(zhì)及規(guī)律，這在一定程度上決定了化學(xué)知識的抽象難懂，導(dǎo)致學(xué)生對化學(xué)學(xué)習(xí)充滿畏懼心理，不愿意主動(dòng)配合教師的教學(xué)活動(dòng)，而對于強(qiáng)調(diào)邏輯思維和動(dòng)手能力的化學(xué)實(shí)驗(yàn)更是敬而遠(yuǎn)之，導(dǎo)致在化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中學(xué)生的參與性較低，不利于化學(xué)實(shí)驗(yàn)的有效開展，也不能有效提高學(xué)生的科學(xué)實(shí)驗(yàn)探究能力。

2.3 AZD2014對大鼠肝移植術(shù)后移植肝臟病理學(xué)的影響

兒童FC主要基于典型的病史和體格檢查做出臨床診斷，一般不需要其他理化檢查。其診斷標(biāo)準(zhǔn)，建議采用羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)（以4歲為界分為嬰兒/幼兒 FC 和兒童/青少年 FC）［1］、《巴黎兒童便秘術(shù)語共識》（PACCT，沒有年齡限制）［8］等。

(3) 在排水管壁試樣面積大小、水力梯度一致的情況下，與殘積礫質(zhì)黏性土相比，殘積砂質(zhì)黏性土的單位體積含土量增長了20%～36%，殘積粉質(zhì)黏性土的單位體積含土量增長了43%～73%，排水管壁試樣單位體積含土量隨著土體中黏粒含量的增大而增大，且增大幅度較其他兩種變量大。

對移植肝臟進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，對照組移植肝內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤區(qū)域有大量的T淋巴細(xì)胞（CD3陽性）浸潤（圖5），但僅有少量散在的Treg細(xì)胞（Foxp3陽性，屬于免疫抑制細(xì)胞）浸潤（圖6）；而AZD2014組的結(jié)果則正好相反，與對照組相比，AZD2014組移植肝內(nèi)Treg細(xì)胞浸潤的數(shù)量顯著增多（圖6），但T淋巴細(xì)胞浸潤的數(shù)量則顯著下降（圖5）。病理檢查結(jié)果證實(shí)對照組的移植肝臟出現(xiàn)了嚴(yán)重的急性排斥反應(yīng)，而AZD2014給藥組的移植肝臟未見典型的排斥反應(yīng)的病理改變。

將移植肝切成大小約0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的組織塊，4%多聚甲醛固定24 h，流動(dòng)自來水沖洗3 h；放入梯度酒精中脫水，酒精濃度依次為75%、85%、95%、100%(I)、100%(II)，每個(gè)梯度脫水45 min；浸泡于二甲苯I和二甲苯II中，各30 min；浸蠟、包埋、切片、撈片、烤片、脫蠟和水化；切片置于蘇木素水溶液中染色5 min，流水洗去蘇木素1 min，再置于1%鹽酸酒精中3 s，稍水洗2 s，自來水中返藍(lán)10 min，蒸餾水洗1 min；切片置于0.5%伊紅染液中2 min，而后用蒸餾水洗2 s；切片置于梯度酒精中脫水，酒精濃度依次為75%、85%、95%、100%(I)、100%(II)，每梯度脫水5 min；二甲苯透明及封片。

3 討論

mTOR信號參與淋巴細(xì)胞的激活及免疫因子的合成，阻斷mTOR信號后，可以使淋巴細(xì)胞發(fā)生G1/S期細(xì)胞阻滯，阻斷淋巴細(xì)胞分裂，進(jìn)而發(fā)揮免疫抑制作用。傳統(tǒng)的單mTORC1抑制劑雷帕鳴是臨床上移植術(shù)后常用的免疫抑制劑。近年來隨著對mTORC2的深入研究，發(fā)現(xiàn)mTORC2信號在免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程中也發(fā)揮著重要作用。因此，我們想了解雙mTORC1/2抑制劑AZD2014是否也具有抑制肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的作用。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，AZD2014可以顯著提高移植受體的存活率（AZD2014組術(shù)后14 d的存活率為4/4，而對照組的大鼠術(shù)后14 d的存活率為1/4），術(shù)后肝功能的檢測和移植肝臟的病理檢查也證實(shí)AZD2014可以有效地抑制同種異基因大鼠肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)。這一結(jié)果與Rosborough 等使用mTOR抑制劑AZD8055抑制小鼠移植心臟急性排斥反應(yīng)的研究相一致。

研究拍照賺錢的任務(wù)定價(jià)并設(shè)計(jì)新的任務(wù)定價(jià)方案，數(shù)據(jù)來源于2018年全國大學(xué)生數(shù)學(xué)建模比賽B題附件（任務(wù)主要集中在廣州市、東菀市和深圳市）．為便于問題研究，假設(shè)：（1）所使用的文獻(xiàn)和結(jié)論都準(zhǔn)確可靠；（2）樣本容量足夠大，樣本數(shù)據(jù)真實(shí)可靠，能夠反映具體情況；（3）用戶選擇只與任務(wù)位置和任務(wù)標(biāo)價(jià)有關(guān)，無其他的影響因素；（4）所收集到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)具有一定的代表性．

mTOR抑制劑能夠發(fā)揮免疫抑制作用的重要機(jī)制之一是誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞發(fā)生G1/S期細(xì)胞阻滯，抑制效應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞的增殖。調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Treg）是免疫系統(tǒng)中重要的調(diào)節(jié)細(xì)胞，可以抑制效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的功能，在誘導(dǎo)和維持移植免疫耐受中起著重要的作用。抑制mTOR信號可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的生成、增殖，增強(qiáng)其免疫抑制功能并維持表型的穩(wěn)定性。本研究中，我們對術(shù)后肝功能的檢測和移植肝臟的病理檢查也證實(shí)AZD2014可以有效地抑制同種異基因大鼠肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)。進(jìn)一步檢測移植肝臟Foxp3（Treg細(xì)胞的重要分子標(biāo)志）和CD3（T細(xì)胞的重要分子標(biāo)志）的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)AZD2014可以顯著增加Foxp3的表達(dá)，同時(shí)抑制CD3的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)抑制mTORC1/2信號后T淋巴細(xì)胞無法分化為Th1、Th2或17效應(yīng)細(xì)胞，但可保留向Foxp3Treg的分化的能力。這些發(fā)現(xiàn)與我們的研究結(jié)果相一致，說明雙mTORC1/2 抑制劑AZD2014 抑制排斥反應(yīng)的機(jī)制與誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成和抑制T淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。

肝移植是治療肝細(xì)胞癌的重要措施之一，具有其它治療方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。特別是符合“米蘭標(biāo)準(zhǔn)”的肝細(xì)胞癌患者，接受肝移植治療后，4年的存活率可高達(dá)85%，而且復(fù)發(fā)率低于15%。肝移植術(shù)后，需要長期應(yīng)用免疫抑制劑，在某種程度上來說會增加肝癌的復(fù)發(fā)率。我們前期研究發(fā)現(xiàn)AZD2014對肝細(xì)胞癌具有抗癌作用。本研究我們又發(fā)現(xiàn)AZD2014可以抑制肝移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)的作用。即AZD2014同時(shí)具有抗癌作用和抗排斥作用。因此，我們認(rèn)為肝癌肝移植術(shù)后，如果選擇AZD2014作為免疫抑制劑，或許可以降低腫瘤的復(fù)發(fā)率；此外，對于肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的患者，改用AZD2014，或許可以同時(shí)兼顧抗排斥和抑制腫瘤進(jìn)展的作用。

綜上所述，我們在同種異基因大鼠肝移植排斥模型中證實(shí)了雙mTORC1/2抑制劑AZD2014可以有效地抑制肝移植術(shù)后的急性排斥反應(yīng)，該作用與誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成和抑制T淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)。