郭蜜，向建琴，張健，李忠正，邱繼文，崔銀潔

(1 天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)研究中心，天津 301600； 2 重慶市陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康管理科)

小膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮核心作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NLRP3)在人類輕度認(rèn)知障礙和阿爾茲海默病(AD)等神經(jīng)變性疾病中發(fā)揮著重要的作用[2-3]。NLRP3作為最具有特色的炎癥小體，是胞漿內(nèi)識(shí)別受體NOD樣受體家族的一員，當(dāng)細(xì)胞受到感染、組織損傷等刺激時(shí)，被激活的NLRP3能夠通過結(jié)合凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)招募半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)前體形成NLRP3炎癥小體，從而促進(jìn)caspase-1前體激活成為caspase-1，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素18(IL-18)的成熟[4]。降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是一種神經(jīng)肽類物質(zhì)，可以直接作用于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，抑制IL-1β的生成與釋放[5-7]。本團(tuán)隊(duì)前期研究顯示，CGRP可以改善脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表達(dá)，具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其分子機(jī)制仍不清楚[8]。NLRP3炎癥小體的激活能夠促進(jìn)大量IL-1β的產(chǎn)生，而CGRP可以抑制IL-1β的生理功能，CGRP與NLRP3炎癥小體之間可能存在著一定的聯(lián)系。為了進(jìn)一步探明二者關(guān)系，本研究采用脂多糖(LPS)與三磷酸腺苷(ATP)誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥小體激活模型，從NLRP3炎癥小體途徑探討CGRP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，購自Santa Cruz Biotechno-logy公司。胎牛血清(Cell Signaling Technology)；LPS(愛必信)；ATP(FERMRNTAS)；β-actin(Santa Cruz Biotechnology)；CGRP抗體(北京義翹神州科技有限公司)；ASC、caspase-1和NLRP3抗體(abcam)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白定量試劑盒(博士德生物工程有限公司)；ECL顯影液和PVDF膜(Millipore)；HRP標(biāo)記二抗(Sigma)。全波長酶標(biāo)儀(Bio-tek，ELX 800)；垂直電泳裝置(北京市六一儀器廠，DYCZ-24DN)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(ThermoForma，form 1341)；LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)(美國UVP公司，GelDoc-It310)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和10 g/L雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放于37 ℃的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞生長融合率80%時(shí)傳代，隔2 d傳代1次，傳代3次后且細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2LPS聯(lián)合ATP激活小膠質(zhì)細(xì)胞最佳模型確定及CGRP最佳劑量篩選 將細(xì)胞分為6組，依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)確定兩種細(xì)胞模型處理?xiàng)l件[9-11]。對照組細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)；模型1組細(xì)胞先加入100 μg/L的LPS作用12 h，然后再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min；模型2組細(xì)胞先加入100 μg/L的LPS作用4 h，然后再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min；CGRP1、CGRP10、CGRP100組細(xì)胞先分別用1、10、100 μg/L的CGRP預(yù)處理1 h，然后加入100 μg/L的LPS作用12 h，再加入5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min。根據(jù)NLRP3蛋白含量篩選出最佳模型和CGRP的最佳作用濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞NLRP3、capase-1、ASC蛋白表達(dá)的檢測 采用蛋白免疫印跡法檢測對照組(A組)、模型組(按篩選出的最佳模型制備方法進(jìn)行處理，B組)、CGRP組(按篩選出的最佳作用濃度的CGRP進(jìn)行處理，C組)細(xì)胞中NLRP3、capase-1和ASC的含量。樣品裂解后提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，浸入脫脂奶粉封閉液中，室溫下于搖床上輕輕搖動(dòng)2 h；然后分別加入兔抗人單克隆NLRP3抗體(1∶100)、ASC抗體(1∶50)、capase-1(1∶200)抗體以及兔抗人多克隆GAPDH抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜。TBS-T洗膜后，將膜于含對應(yīng)二抗(HRP標(biāo)記二抗)的脫脂奶粉溶液中，室溫作用1.5 h，用ECL顯影液顯影，用LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng)攝像，分析條帶的光密度值。

1.2.4細(xì)胞IL-1β表達(dá)的ELISA檢測 收集對照組、模型組和CGRP組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，嚴(yán)格按照IL-1β檢測試劑盒的說明進(jìn)行檢測。反應(yīng)終止后使用全波長酶標(biāo)儀于450 nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組樣本吸光度值對應(yīng)的濃度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 最佳模型與CGRP最佳作用濃度

對照組、模型1組、模型2組以及CGRP1、CGRP10、CGRP100組NLRP3蛋白表達(dá)量分別為0.215±0.003、0.394±0.006、0.303±0.002、0.054±0.000、0.036±0.000、0.047±0.000(n=3)。對照組、模型1組、模型2組NLRP3表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=7.200，P<0.05)，其中模型1組NLRP3蛋白表達(dá)量最高，因此選擇模型1為最佳模型進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對照組、模型1組以及CGRP1、CGRP10、CGRP100組NLRP3表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=13.573，P<0.05)，其中CGRP10組NLRP3蛋白表達(dá)量最低，因此選擇10 μg/L的CGRP進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

2.2 CGRP對NLRP3、ASC、capase-1和IL-1β蛋白表達(dá)的影響

模型組細(xì)胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的蛋白表達(dá)較對照組明顯升高，CGRP組細(xì)胞上述蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，差異均有顯著意義(F=7.261～151.232，P<0.05)。表明CGRP可以抑制炎癥小體NLRP3的激活從而減輕炎癥反應(yīng)。見圖2和表1。

圖1 以NLRP3蛋白表達(dá)為標(biāo)準(zhǔn)確定最佳模型與CGRP最佳作用濃度

圖2 各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1和ASC表達(dá)的蛋白免疫印跡檢測

表1 各組細(xì)胞NLRP3、caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

NLRP3炎癥小體異?；罨a(chǎn)生的過度炎癥反應(yīng)與人類多種疾病密切相關(guān)，其中包括AD、脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12-13]。已有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在AD模型中，NLRP3基因敲除的小鼠空間記憶能力顯著提升，運(yùn)動(dòng)功能障礙與多巴胺能神經(jīng)元退行性病變得以改善[14]；在脊髓損傷模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎癥小體活化，并進(jìn)一步激活核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路，形成級聯(lián)式炎癥反應(yīng)，加速神經(jīng)元的死亡[15]。因此，抑制NLRP3炎癥小體的過度激活可能是預(yù)防或治療神經(jīng)炎性疾病的關(guān)鍵。

研究發(fā)現(xiàn)，體外NLRP3炎癥小體的激活需要兩個(gè)信號：信號1是指當(dāng)細(xì)胞受到LPS的刺激時(shí)，Toll樣受體4(TLR4)迅速識(shí)別，激活NF-κB通路，導(dǎo)致pro-IL-1β和NLRP3蛋白水平的上調(diào)；信號2是指高濃度ATP刺激P2X7，導(dǎo)致K+外流，促進(jìn)ASC和caspase-1的集合，從而導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活[16]。有研究表明，將ATP與LPS聯(lián)合激活NLRP3炎癥小體，可以縮短作用時(shí)間，并且刺激效果更顯著[17]。但文獻(xiàn)中未報(bào)道LPS聯(lián)合ATP激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的具體濃度與反應(yīng)時(shí)間。因此，本研究首先通過實(shí)驗(yàn)確定LPS聯(lián)合ATP激活BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎癥小體的最佳模型，結(jié)果表明，先以100 μg/L的LPS作用12 h，然后再以5 mmol/L的ATP繼續(xù)作用45 min，小膠質(zhì)細(xì)胞中炎癥小體的激活最為顯著，因此選用該濃度和反應(yīng)時(shí)間建立體外小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3激活模型。

CGRP為一種由37個(gè)氨基酸構(gòu)成的多功能神經(jīng)肽，是目前已知最強(qiáng)的擴(kuò)血管物質(zhì)，尤其對腦血管擴(kuò)張具有極強(qiáng)的作用[18]。在免疫炎癥方面，CGRP具有抗炎和促炎雙向調(diào)節(jié)作用。例如，注射CGRP后，煙曲霉感染的真菌性角膜炎小鼠角膜組織中的IL-1β水平明顯降低，角膜炎癥狀隨之減輕，CGRP發(fā)揮了抗炎作用[19]；而在偏頭痛模型中，CGRP則通過一系列反應(yīng)參與三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)神經(jīng)源性炎癥從而引發(fā)偏頭痛[20]。為了進(jìn)一步了解CGRP在炎癥中的作用，本研究將不同濃度的CGRP作用于BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果表明CGRP可以顯著抑制NLRP3炎癥小體的激活，但該作用并不呈濃度依賴性。因此我們推測，CGRP發(fā)揮抗炎和促炎的不同作用可能與其組織特性有關(guān)。既往有研究還表明，CGRP具有神經(jīng)保護(hù)作用，該作用可能與CGRP抑制低氧海馬神經(jīng)元c-fos的表達(dá)，降低高閾值鈣電流，抑制低氧時(shí)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流有關(guān)[21]，但其具體機(jī)制尚不很清楚。本團(tuán)隊(duì)在研究CGRP與炎癥關(guān)系時(shí)顯示，CGRP和NLRP3炎癥小體之間存在著千絲萬縷的關(guān)系：CGRP可以抑制IL-1β和抗原呈遞細(xì)胞，而NLRP3炎癥小體的激活則可以促進(jìn)IL-1β的表達(dá)[22]；對比CGRP與NLRP3細(xì)胞內(nèi)激活與傳遞途徑顯示，二者存在共同的信號通路cAMP/PKA[23-24]。因此，我們推測CGRP與NLRP3之間可能存在一定的調(diào)控關(guān)系，故而設(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn)。本文結(jié)果表明，CGRP可以降低LPS聯(lián)合ATP誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1的蛋白含量，減少細(xì)胞中IL-1β的表達(dá)，提示CGRP可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的激活。本研究揭示了CGRP神經(jīng)保護(hù)的又一作用機(jī)制，為臨床上CGRP治療神經(jīng)炎性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。