李雪麗,曹彩霞,宋潔,馮文靜,鐘麗娜,楊學(xué)成

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 內(nèi)分泌與代謝科； 2 老年醫(yī)學(xué)科； 3 泌尿外科)

作為繼發(fā)性高血壓常見原因之一的嗜鉻細(xì)胞瘤/副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)是一種少見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，國內(nèi)尚沒有確切的患病率統(tǒng)計(jì)[1]。臨床研究顯示，有15%～17%的PCPG可以發(fā)展為轉(zhuǎn)移性PCPG，而轉(zhuǎn)移性PCPG治療選擇有限，預(yù)后差，通常5年存活率不到50%[2]；并且腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的主要原因[3]。世界衛(wèi)生組織已將PCPG歸類到有轉(zhuǎn)移可能的腫瘤類目中，而術(shù)前生化檢測(cè)和前期病理結(jié)果均難以判斷PCPG是否具有轉(zhuǎn)移性[4]。國內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為，PCPG的發(fā)生發(fā)展在很大程度上是受基因組的改變驅(qū)動(dòng)，如SDHx和VHL基因的改變導(dǎo)致三羧酸循環(huán)中斷，低氧相關(guān)因子表達(dá)增加[1,5]；MAX、RET和TMEM127等抑癌基因激活促進(jìn)腫瘤生長基因的蛋白翻譯[6-7]。PCPG具有較強(qiáng)的遺傳背景，目前已經(jīng)報(bào)道了20多個(gè)易感基因[8]，約50%的病人存在胚系或體系基因突變[1]。目前常用腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤評(píng)分(PASS)和腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤及副神經(jīng)節(jié)瘤分級(jí)系統(tǒng)(GAPP)評(píng)估PCPG的惡性生物學(xué)特征[9]。但在個(gè)體病人中致病基因的改變差異較大，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移進(jìn)展較慢，僅憑評(píng)分結(jié)果、總體生存期和無進(jìn)展生存期，難以精準(zhǔn)地對(duì)病人的疾病進(jìn)展進(jìn)行評(píng)估。故迫切需要從宏觀角度捕捉可能與該病進(jìn)展相關(guān)的基因變化，綜合相關(guān)基因的內(nèi)在機(jī)制判斷腫瘤的發(fā)生發(fā)展，為未來開展基因信息監(jiān)測(cè)、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)干預(yù)提供研究基礎(chǔ)。

近年來，微陣列分析和測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為篩選致病基因，識(shí)別具有診斷、治療價(jià)值的生物標(biāo)志物的有效技術(shù)，如LIN等[10]的研究通過微陣列芯片確定了KCNQ1和SCN2A是PCPG中的異常甲基化基因。生物信息學(xué)分析為高通量測(cè)序技術(shù)提供了快速有效的分析途徑，其與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，COX4I2和PLAT蛋白與PCPG供血高度相關(guān)[11]。NCBI基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(GEO)可以提供大量針對(duì)各種人類腫瘤的微陣列分析數(shù)據(jù)和下一代測(cè)序數(shù)據(jù)，儲(chǔ)存了大量未被挖掘的差異表達(dá)基因(DEGs)。探究與PCPG相關(guān)的特異性DEGs及其可能參與的病理功能有助于更好地理解PCPG的進(jìn)展。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫的微陣列芯片數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)分析篩選核心DEGs并探討其可能的分子機(jī)制，以期為PCPG的發(fā)生發(fā)展提供新的研究視角。

1 資料與方法

1.1 微陣列芯片初始數(shù)據(jù)的獲取

通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取PCPG基因微陣列芯片(GSE60458)數(shù)據(jù)，其中共包含62 976個(gè)探針的初始數(shù)據(jù)，來自于12例PCPG組織樣本(PCPG組，良性9例，惡性3例)和3例正常腎上腺髓質(zhì)組織樣本(Normal組)。并且通過GPL13607平臺(tái)(Agilent-028004 SurePrint G3 Human GE 8x60K Microarray)識(shí)別探針信號(hào)對(duì)應(yīng)的基因名稱。

1.2 DEGs的篩選

利用在線NetworkAnalyst 3.0系統(tǒng)，對(duì)微陣列芯片初始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和背景校正處理。使用該系統(tǒng)的Limma包對(duì)PCPG組和Normal組做層次聚類分析，以log2|Fold Change|>2且P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選DEGs，以熱圖顯示DEGs表達(dá)譜，以火山圖展示所有DEGs的顯著性差異。并以DEGs為變量進(jìn)行主成分分析(PCA)，觀察PCPG組和Normal組樣本的差異。

1.3 DEGs功能預(yù)測(cè)

為探究DEGs可能參與的通路，將全部DEGs輸入KOBAS v3.0(KEGG Orthology Based Annotation System v3.0)線上數(shù)據(jù)平臺(tái)，進(jìn)行在線GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes)通路富集分析，以P<0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05為基因富集通路有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 核心DEGs篩選

使用STRING v11.0工具將表達(dá)差異最大的40個(gè)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，將連接于模塊中的基因作為核心DEGs，并將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.5 核心DEGs表達(dá)水平驗(yàn)證

為驗(yàn)證GSE60458微陣列芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，在GEPIA2平臺(tái)上TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中獲取182例PCPG標(biāo)本(Tumor組)和3例正常對(duì)照標(biāo)本(Normal組)，分析兩組核心DEGs的表達(dá)情況。使用Origin 2016軟件構(gòu)建生物信息學(xué)分析結(jié)果圖，采用雙側(cè)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)組間的差異，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PCPG差異基因表達(dá)及分布特征

PCA顯示，DEGs將兩組樣本從兩個(gè)主成分維度(PC1、PC2)完全分離，說明DEGs表達(dá)模式具有特異性，可用于完全區(qū)分PCPG組織和正常腎上腺組織。同時(shí)觀察到PCPG組9例良性腫瘤樣本和3例惡性腫瘤樣本未能完全分離，說明良惡性腫瘤組織DEGs表達(dá)模式的特異性差。見圖1。

分析GSE60458芯片中的所有基因的表達(dá)結(jié)果，DEGs共有1 903個(gè)(圖2)，其中表達(dá)上調(diào)基因864個(gè)，下調(diào)基因1 039個(gè)(圖3)。表達(dá)上調(diào)DEGs前10位依次為EGR、SCRT2、C1QL1、SOHLH1、CD163L、lincRNA:chr5:1731、CHRNA4、TLX3、NR4A1和ENST0000031680，表達(dá)下調(diào)DEGs前10位依次為HSD3B1、HSD3B2、MRAP、AADAC、CYP11B2、GSTA5、LOC391081、CYP11B1、MGST1和KCNK2(圖4)。

紅色代表PCPG組12例樣本，包括9例良性腫瘤樣本和3例惡性腫瘤樣本，藍(lán)色代表Normal組3例樣本。

藍(lán)色為表達(dá)下調(diào)DEGs，紅色為表達(dá)上調(diào)DEGs，顏色越深表示DEGs的表達(dá)量越高或越低。

藍(lán)色為顯著下調(diào)DEGs，紅色為顯著上調(diào)DEGs，黑色為表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因。

2.2 DEGs的GO和KEGG富集分析

GO富集分析結(jié)果顯示，DEGs富集于1 593條通路，DEGs富集度最大的5條通路分別為蛋白結(jié)合(Protein binding)、細(xì)胞質(zhì)膜(Plasma membrane)、胞外區(qū)(Extracellular region)、細(xì)胞膜的有機(jī)構(gòu)成(Integral component of membrane)和細(xì)胞外間隙(Extracellular space)。見圖5。KEGG通路富集于145條通路，其中富集度最大的5條通路分別為代謝途徑(Metabolic pathways)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、病毒蛋白與細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體的相互作用(Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)、癌癥通路(Pathways in cancer)和藥物代謝-細(xì)胞色素P450(Drug metabolism-cytochrome P450)。見圖6。

藍(lán)色為表達(dá)下調(diào)DEGs，紅色為表達(dá)上調(diào)DEGs，顏色越深表示DEGs的表達(dá)量越高或越低。

氣泡大小表示富集的基因個(gè)數(shù)多少，顏色表示P值的大小。

2.3 核心DEGs篩選

本研究采用STRING v11.0工具軟件對(duì)表達(dá)差異最大的40個(gè)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，并將PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、EGR4、STAR、SULT2A1、NR4A1和HSD3B1等10個(gè)基因位于緊密連接的模塊中，認(rèn)定為核心DEGs(圖7)。該模塊由10個(gè)節(jié)點(diǎn)和32條連接線組成，結(jié)合GO和KEGG富集分析結(jié)果，CYP11B1、CYP11B2、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1和HSD3B2基因參與甾類激素生物合成(Steroid hormone biosynthesis)，CYP11B1、CYP11B2基因參與氧化還原過程(Oxidation-reduction process)，CYP11B1、CYP11B2和HSD3B2基因共同參與鈣離子結(jié)合(Calcium ion binding)，CYP11B1、HSD3B2基因以及HSD3B1基因參與代謝通路(Metabolic pathways)，NR4A1基因參與MAPK信號(hào)通路(MAPK signaling pathway)。

2.4 核心DEGs表達(dá)水平驗(yàn)證

利用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫，對(duì)GSE60458芯片的分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。與Normal組相比，Tumor組病人CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP17A1、HSD3B2、STAR和SULT2A1等7個(gè)核心DEGs的表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，與GSE60458數(shù)據(jù)集的結(jié)果相同；而HSD3B1、NR4A1和EGR4等3個(gè)核心DEGs表達(dá)水平無明顯變化，與GSE60458數(shù)據(jù)集的結(jié)果相似。見圖8。

氣泡大小表示富集的基因個(gè)數(shù)多少，顏色表示P值的大小。

節(jié)點(diǎn)代表DEGs的表達(dá)產(chǎn)物，連接線表示兩個(gè)節(jié)點(diǎn)參與同一個(gè)功能，連接線粗細(xì)表示置信度大小。

3 討 論

探究腫瘤組織和正常組織之間的差異是腫瘤研究的主要內(nèi)容。PCPG是少見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，由于臨床數(shù)據(jù)及組織標(biāo)本難以大量獲得，這限制了科研人員對(duì)該病的探究。腫瘤基因微陣列芯片中包含了大量有潛在研究價(jià)值的信息，生物信息學(xué)的運(yùn)用可以從宏觀角度對(duì)有潛在研究價(jià)值的基因進(jìn)行篩選，進(jìn)而加快研究進(jìn)程。但隨著高通量技術(shù)的普及和大數(shù)據(jù)庫的發(fā)展，“數(shù)據(jù)泛濫”成為生物信息學(xué)分析的一個(gè)難點(diǎn)。而PCA可以將多維度數(shù)據(jù)有效地降維分析[12]。本研究對(duì)所有樣本進(jìn)行了PCA，觀察到PCPG組和Normal組可以從兩個(gè)主成分維度完全分離，說明PCPG組織和正常腎上腺組織在基因表達(dá)模式上具有顯著的差異。而PCPG組9例良性腫瘤樣本和3例惡性腫瘤樣本則未能完全分離，提示PCPG良惡性組織基因表達(dá)模式差異較小。日本學(xué)者統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，有60%的惡性PCPG最初被診斷為良性PCPG[4]，本研究PCA結(jié)果也從側(cè)面驗(yàn)證了這一事實(shí)。

本研究從GSE60458芯片數(shù)據(jù)集中共確定了1 903個(gè)DEGs，表明腫瘤的形成過程是一個(gè)涉及癌基因、抑癌基因和其他基因改變的復(fù)雜過程。DEGs通路富集分析進(jìn)一步表明，DEGs主要參與了與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程，如胞外外泌體、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號(hào)、Ras信號(hào)通路以及MAPK信號(hào)通路等。有研究發(fā)現(xiàn)，PCPG病人的循環(huán)外泌體中存在雙鏈DNA片段，且外泌體DNA片段與腫瘤細(xì)胞易感基因具有相同的突變[13]；NRF2基因激活可以通過抑制氧化應(yīng)激和促進(jìn)腫瘤炎癥來降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)[14]；白細(xì)胞介素-33(IL-33)通過調(diào)節(jié)趨化因子，招募、激活固有免疫細(xì)胞，從而創(chuàng)造促腫瘤環(huán)境[15]；在肺癌研究中，Treg細(xì)胞中IC(Immune checkpoint)分子表達(dá)水平升高，程序性死亡受體1(PD-1)表達(dá)增加，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制活性[16]。近年來，PCPG病因相關(guān)基因的發(fā)現(xiàn)使轉(zhuǎn)移性PCPG的診斷和治療取得了重大進(jìn)展，為了精準(zhǔn)地對(duì)疾病進(jìn)展進(jìn)行個(gè)體化基因信息監(jiān)測(cè)，還需要更為高效的分析技術(shù)。

由于篩選出的1 903個(gè)DEGs的信息眾多，為精確研究范圍，本研究通過STRING v11.0工具將表達(dá)差異最大的40個(gè)DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，結(jié)果顯示，10個(gè)核心DEGs存在著直接或間接地相互作用。表明核心基因表達(dá)水平的變化有可能干擾PCPG的發(fā)生和發(fā)展。通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證10個(gè)核心基因表達(dá)水平，結(jié)果與GSE60458芯片結(jié)果一致。其中HSD3B1、NR4A1和EGR4基因的表達(dá)水平兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中正常對(duì)照組納入的樣本數(shù)量有限，數(shù)據(jù)存在偏移，提示仍需收集腫瘤標(biāo)本和臨床數(shù)據(jù)，進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

紅色為PCPG腫瘤組織(Tumor組，182例)，灰色為正常腎上腺組織(Normal組，3例)，*P<0.05。

本文富集分析結(jié)果顯示，CYP11B1、CYP11B2、CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1、HSD3B2等基因共同參與甾類激素的生物合成。類固醇生成酶分為細(xì)胞色素P450和羥基類固醇脫氫酶/酮類固醇還原酶兩類，包括CYP11A1、CYP11B1、CYP11B2、HSD3B2、HSD11B1、HSD11B2等[17-18]。甾類激素生物合成是在多種酶和輔助因子的參與下，由膽固醇經(jīng)多步酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為具有生物活性的甾類激素，涉及多種細(xì)胞的生理功能。膽固醇是免疫細(xì)胞膜的基本脂質(zhì)成分，可以通過T細(xì)胞獲得，并參與細(xì)胞激活、增殖、代謝等[19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤膽固醇通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路[20]，或誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞功能衰竭[21]，使抗腫瘤免疫失活；氧甾醇通過與核肝X受體(LXR)α和LXRβ相互作用，發(fā)揮內(nèi)源性脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用，招募促血管生成和免疫抑制的中性粒細(xì)胞[22]，建立促腫瘤微環(huán)境；腺體外類固醇激素合成失調(diào)降低了免疫細(xì)胞自身的抗腫瘤能力[23]。腫瘤細(xì)胞可通過破壞免疫細(xì)胞功能，造成抗腫瘤免疫反應(yīng)鈍化，從而逃避免疫殺傷。此外，轉(zhuǎn)錄因子也可能參與抗腫瘤免疫。NR4A1基因位于12號(hào)染色體，有12個(gè)外顯子，編碼核轉(zhuǎn)錄因子。有文獻(xiàn)報(bào)道，NR4A1轉(zhuǎn)錄因子在耐受性T細(xì)胞中表達(dá)增加，缺失NR4A1則可降低T細(xì)胞的耐受性，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的免疫力[24]。本研究芯片分析結(jié)果顯示，NR4A1表達(dá)上調(diào)，通路富集顯示NR4A1參與MAPK信號(hào)通路，可能通過影響PCPG激酶信號(hào)通路[1]，參與腫瘤的發(fā)生。

本研究分析報(bào)告了兩個(gè)在PCPG中鮮有研究的DEGs。SOHLH1基因位于9號(hào)染色體，其編碼蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。LIU等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Sohlh1蛋白在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)下調(diào)，且與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了Sohlh1通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[25]。Wnt信號(hào)通路在PCPG中已有深入的研究，如CSDE1體細(xì)胞突變及MAML3的體細(xì)胞基因融合激活Wnt和Hedgehog信號(hào)通路[3]，使PCPG表現(xiàn)為強(qiáng)侵襲性。SOHLH1基因表達(dá)上調(diào)，可能參與PCPG的轉(zhuǎn)移，提示該基因可能成為腫瘤行為的預(yù)測(cè)因子。SCRT2基因編碼Scratch家族轉(zhuǎn)錄抑制因子2，位于20號(hào)染色體。研究發(fā)現(xiàn)，Scratch1和Scratch2由黏附分子E-cadherin介導(dǎo)，通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制，參與神經(jīng)上皮細(xì)胞向神經(jīng)元遷移或向中間神經(jīng)元祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化[26]。但SCRT2在PCPG中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，本研究篩選出的10個(gè)核心DEGs可能影響甾類激素的生物合成，參與調(diào)控PCPG的發(fā)生發(fā)展，這為預(yù)測(cè)PCPG的潛在生物標(biāo)志物提供了研究依據(jù)。