高洪瑞,閆慧,潘洋,郝巖,李健

(青島大學(xué),山東 青島 266071 1 醫(yī)學(xué)部； 2 附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一類毒素，其中黃曲霉素B1(AFB1)毒性最大、危害最嚴(yán)重[1]，可對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重?fù)p害，包括致癌、致突變和肝臟損傷等[2]。AFB1的主要靶器官是肝臟[3]，但一些研究表明，AFB1也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟損傷，其機(jī)制涉及線粒體損傷、活性氧(ROS)生成和細(xì)胞凋亡等[4-5]。丹參是一種傳統(tǒng)的中藥，具有活血化瘀之功效[6]，丹參多酚酸鹽是丹參的水溶性有效活性部分，有很強(qiáng)的抗氧化、抗凋亡、內(nèi)皮保護(hù)和舒張血管等作用[7]，臨床上主要應(yīng)用于冠心病的治療[8]。有研究表明，急性心肌梗死病人經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療圍術(shù)期靜脈輸注丹參多酚酸鹽可有效改善氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)心功能恢復(fù)，增加心肌灌注量[9]。但丹參多酚酸鹽對(duì)AFB1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化損傷的影響鮮有報(bào)道。本文研究通過(guò)AFB1誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞(H9C2細(xì)胞)制備氧化損傷模型，評(píng)估丹參多酚酸鹽對(duì)H9C2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，為丹參多酚酸鹽的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及試劑

H9C2細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司；AFB1(百靈威科技有限公司，純度98%)；丹參多酚酸鹽(上海綠谷制藥有限公司，每瓶100 mg)；DMEM高糖培養(yǎng)液(美國(guó)HyClone公司)；胎牛血清(FBS，BI)；二甲基亞砜(DMSO)、5XTris-甘氨酸電泳緩沖液、10×電轉(zhuǎn)液均購(gòu)自北京索萊寶公司；CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、10×TBST均購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；過(guò)氧化物歧化酶2(SOD2)抗體、過(guò)氧化氫酶(CAT)抗體(Anti-Catalase)均購(gòu)自abcam公司;GAPDH(博奧森生物技術(shù)有限公司)；Anti-Rabbit IgG(H+L，Elabscience生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1H9C2細(xì)胞培養(yǎng) H9C2細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)0.10的FBS和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞)、AFB1誘導(dǎo)模型組(在DMEM培養(yǎng)液中加入濃度128 μmol/L的AFB1)及低、中、高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組(在培養(yǎng)液中加入濃度128 μmol/L的AFB1+濃度分別為5、20、40 mg/L丹參多酚酸鹽)。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞密度調(diào)整為5×107/L，接種于96孔板，每孔100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育過(guò)夜(15～18 h)，分組加藥。①設(shè)置正常對(duì)照組(H9C2細(xì)胞加入DMEM培養(yǎng)液)、DMSO組(DMEM培養(yǎng)液中加濃度2 g/L的DMSO)和AFB1組(AFB1終濃度分別為32、64、96、128、160、192 μmol/L), 以細(xì)胞存活率接近50%為最佳的藥物造模濃度；②設(shè)置正常對(duì)照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞)、不同濃度的丹參多酚酸鹽組(丹參多酚酸鹽濃度分別為5、10、20、40、50、60 mg/L)，確定丹參多酚酸鹽的安全使用濃度；③設(shè)置正常對(duì)照組(用DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)H9C2細(xì)胞)和最佳濃度(128 μmol/L)AFB1+丹參多酚酸鹽組(丹參多酚酸鹽濃度分別為0、5、20、40 mg/L)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)36 h后，吸除原培養(yǎng)液，然后每孔加入100 μL(含有CCK-8試劑10 μL)的無(wú)血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)箱孵育1.5 h后，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔吸光度-空白孔吸光度)/(對(duì)照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，消化、重懸、計(jì)數(shù)后，將細(xì)胞密度調(diào)整為1.5×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h后待細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80%融合，吸去細(xì)胞上清液，按照“1.2.1”方法分組及處理36 h后，倒置相差顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4DCFH-DA染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的H9C2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種至96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。孵育24 h后，吸除原培養(yǎng)液，按照 “1.2.1”方法分組并處理，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。藥物作用36 h后，吸除原培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含有DCFH-DA(10 μmol/L)探針的無(wú)血清培養(yǎng)液，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min。用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)為502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm)，并應(yīng)用Image J軟件分析各組熒光強(qiáng)度。

1.2.5Western blot方法檢測(cè)抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平 各組細(xì)胞干預(yù)36 h后，采用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，分別應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)0.10和0.15的SDS-PAGE對(duì)蛋白進(jìn)行分離，之后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。應(yīng)用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入1∶2 000的GAPDH、SOD2和CAT一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗(抗兔抗體，1∶5 000)37 ℃搖床上孵育1.5 h，通過(guò)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，并用Image J軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)以目標(biāo)蛋白條帶的灰度值/GAPDH條帶的灰度值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 最佳藥物造模濃度及丹參多酚酸鹽安全濃度

隨著AFB1濃度的升高，細(xì)胞相對(duì)存活率呈劑量依賴性下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=293.056，P<0.05)；當(dāng)AFB1的濃度達(dá)到128 μmol/L時(shí)，H9C2細(xì)胞相對(duì)存活率為56.83%，符合造模條件。故選擇AFB1濃度128 μmol/L作為造模濃度。與空白對(duì)照組相比，0～50 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細(xì)胞，細(xì)胞相對(duì)存活率無(wú)明顯變化(P>0.05)；60 mg/L濃度丹參多酚酸鹽作用于H9C2細(xì)胞，細(xì)胞相對(duì)存活率下降(F=2.387，P<0.05)。0～50 mg/L濃度的丹參多酚酸鹽為安全使用濃度。

2.2 各組 H9C2細(xì)胞形態(tài)比較

空白對(duì)照組H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞呈梭形，緊密連接，邊界清晰可見，貼壁牢固；AFB1誘導(dǎo)模型組H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)密度較低，細(xì)胞間空隙增加，可見大片細(xì)胞脫落，部分細(xì)胞收縮變圓、形狀不規(guī)則，可見細(xì)胞碎片；不同劑量丹參多酚酸鹽干預(yù)組H9C2細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)及狀態(tài)得到一定改善。見圖1。

2.3 丹參多酚酸鹽對(duì)H9C2細(xì)胞損傷的影響

與空白對(duì)照組比較，AFB1誘導(dǎo)模型組細(xì)胞相對(duì)存活率降低；與AFB1誘導(dǎo)模型組相比較，高濃度的丹參多酚酸鹽干預(yù)組細(xì)胞相對(duì)存活率升高，差異有顯著性(F=226.937，P<0.05)。見表1。

2.4 丹參多酚酸鹽對(duì)心肌細(xì)胞ROS水平影響

熒光顯微鏡下各組H9C2細(xì)胞內(nèi)ROS觀察結(jié)果見圖2。與正常對(duì)照組相比，AFB1誘導(dǎo)模型組細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；與AFB1誘導(dǎo)模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組ROS水平顯著降低，差異有顯著性(F=62.751，P<0.05)。見表1。

A:正常對(duì)照組；B:AFB1誘導(dǎo)模型組；C:低濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組；D:中濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組；E:高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組。100倍。

A：正常對(duì)照組；B:AFB1誘導(dǎo)模型組；C:低濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組；D:中濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組；E:高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組。DCFH-DA染色，100倍。

2.5 各組抗氧化蛋白SOD2和CAT表達(dá)比較

與正常對(duì)照組比較，AFB1誘導(dǎo)模型組心肌細(xì)胞SOD2、CAT蛋白表達(dá)降低；與AFB1誘導(dǎo)模型組相比，高濃度丹參多酚酸鹽干預(yù)組SOD2、CAT蛋白表達(dá)增加，差異有顯著意義(F=12.090、8.023，P<0.05)。見表1。

3 討 論

AFB1是毒性最強(qiáng)、最常見的黃曲霉毒素，被歸類為第一類致癌物。既往研究表明，AFB1誘導(dǎo)毒性的原因之一是氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激導(dǎo)致抗氧化酶活力降低及ROS過(guò)量生成，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的損傷[10]。也有研究表明，AFB1誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體損傷從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[4-5]。丹參多酚酸鹽具有較強(qiáng)的抗氧化活性，體內(nèi)外研究結(jié)果顯示，其可通過(guò)降低ROS水平，穩(wěn)定細(xì)胞線粒體膜電位，改善與恢復(fù)細(xì)胞功能活性[11]。有研究表明，丹參多酚酸鹽可抑制H2O2處理的大鼠心肌細(xì)胞ROS的過(guò)量生成[11]，可通過(guò)抑制氧化損傷來(lái)防治H2O2所致的大鼠心肌細(xì)胞重構(gòu)[12]。本研究以128 μmol/L濃度的AFB1作用大鼠H9C2細(xì)胞制備心肌細(xì)胞損傷模型，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，AFB1誘導(dǎo)模型組心肌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞相對(duì)存活率顯著降低，提示AFB1對(duì)心肌細(xì)胞有明顯的毒性作用；與AFB1誘導(dǎo)模型組相比，應(yīng)用高濃度丹參多酚酸鹽(40 mg/L)干預(yù)H9C2細(xì)胞36 h，細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量有所改善，細(xì)胞相對(duì)存活率增加，說(shuō)明高濃度的丹參多酚酸鹽對(duì)心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。

表1 各組H9C2細(xì)胞相對(duì)存活率、ROS水平及抗氧化蛋白表達(dá)比較

綜上所述，丹參多酚酸鹽對(duì)AFB1損傷的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善SOD2、CAT等抗氧化酶活力，進(jìn)而促進(jìn)過(guò)量ROS的清除，減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。本研究可為臨床防治心臟損傷相關(guān)疾病提供新思路。