蘇 鈺，朱文浩

全球疾病負(fù)擔(dān)研究(GBD)顯示，我國(guó)總體腦卒中終生發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為39.9%，位居全球首位，也是我國(guó)疾病所致壽命損失的首位病因[1]。缺血性腦卒中導(dǎo)致腦組織缺血，神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)法維持正常的跨膜離子梯度和平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、興奮性毒性、氧化應(yīng)激和炎癥等一系列細(xì)胞死亡的發(fā)生[2]。炎癥反應(yīng)研究是當(dāng)前腦卒中研究的熱點(diǎn)之一。

“炎性小體”一詞由Tschopp Jürg博士等在2002年首次提出[3]，并將炎性小體描述為一個(gè)“Caspase激活復(fù)合物”，由半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、Caspase-5、Pycard(Caspase相互作用域)和NALP1(NLRP1的舊名稱)組成，該復(fù)合物負(fù)責(zé)促炎性因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的成熟[4]。在先天免疫系統(tǒng)參與免疫應(yīng)答時(shí)，當(dāng)檢測(cè)到微生物成分或內(nèi)源性損傷信號(hào)后，由模式識(shí)別受體(PRR)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(PAMPs和DAMPs)，觸發(fā)啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)各種免疫應(yīng)答，并導(dǎo)致形成一個(gè)稱為炎性小體的多蛋白復(fù)合體[5]。炎性小體主要是由不同的受體蛋白(如NLRP1、NLRP3、NLRP4和AIM2等)、銜接蛋白[凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)]和效應(yīng)蛋白半胱氨酸蛋白酶-1前體(pro-Caspase-1)組成的多蛋白復(fù)合體[6]。炎性小體的傳感器通過(guò)ASC的胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)招募pro-Caspase-1形成炎性小體，隨后促炎性因子白細(xì)胞介素-1β前體(pro-IL-1β)和白細(xì)胞介素-18前體(pro-IL-18)可被Caspase-1裂解為促炎癥分子的活性形式，啟動(dòng)下游信號(hào)通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)[7-8]。研究顯示,炎性小體在缺血性腦卒中后的炎癥反應(yīng)中有關(guān)鍵作用。本研究對(duì)NLRP3炎性小體、NLRP1炎性小體、NLRP4炎性小體和AIM2炎性小體的結(jié)構(gòu)組成、激活模式及在缺血性腦卒中發(fā)病機(jī)制中的作用進(jìn)行論述。

1 NLRP3炎性小體

1.1 NLRP3炎性小體的結(jié)構(gòu)與組成 NLRP3炎性小體由NLRP3受體、ASC、pro-Caspase-1 三部分組成。NLRP3受體包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：包含C-端的亮氨酸重復(fù)序列(LRR)、中心的核苷酸寡聚化(NACHT)結(jié)構(gòu)域、N-端的熱蛋白(PYD)結(jié)構(gòu)域和胱天蛋白酶募集(CARD)結(jié)構(gòu)域[9]。

1.2 NLRP3炎性小體的激活 在健康的細(xì)胞條件下，由于NACHT結(jié)構(gòu)域和LRRs之間的內(nèi)部相互作用，NLRP3被自動(dòng)抑制[10]。在檢測(cè)到細(xì)胞應(yīng)激后，NLRP3的NACHT結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)同型交互作用寡聚，其PYD與含有ASC的PYD結(jié)構(gòu)域相互作用，之后ASC又通過(guò)CARD/CARD交互招募pro-Caspase-1[10]。最后，pro-Caspase-1自我切割并形成活性Caspase-1，并介導(dǎo)成熟的、具有生物活性的細(xì)胞因子參與免疫防御[5]。

NLRP3炎性小體的組裝和下游信號(hào)的激活依賴于兩種與細(xì)胞損傷相關(guān)的互補(bǔ)信號(hào)：一種啟動(dòng)信號(hào)，需要通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路上調(diào)NLRP3炎性小體復(fù)合物蛋白、pro-IL-1β及pro-IL-18[11]；第二種信號(hào)導(dǎo)致NLRP3激活和ASC磷酸化，從而觸發(fā)其組裝到NLRP3炎性小體復(fù)合物中[12]。NLRP3對(duì)一系列不同的物質(zhì)刺激產(chǎn)生反應(yīng)，這些物質(zhì)包括晶體和顆粒物質(zhì)(如尿酸晶體、二氧化硅、石棉和明礬)、細(xì)胞外ATP、成孔毒素、RNA-DNA雜交體以及幾種病毒、細(xì)菌、真菌和原生動(dòng)物病原體[13]。NLRP3受體可以感受到動(dòng)態(tài)平衡的紊亂，并通過(guò)以下幾個(gè)過(guò)程做出反應(yīng)自大多數(shù)是相互協(xié)同不排斥的：①胞漿中低K+濃度可觸發(fā)NLRP3活化；②胞內(nèi)Ca2+積累可誘導(dǎo)有害信號(hào)通路，激活NLRP3炎性小體；③溶酶體不穩(wěn)定可刺激組織蛋白酶釋放，誘導(dǎo)NLRP3活化；④線粒體損傷誘導(dǎo)的活性氧(ROS)生成可激活NLRP3，損傷線粒體DNA[14]。此外研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶7(PK7)對(duì)于NLRP3的激活是必不可少的，并且作用于鉀外流的下游[13]。

1.3 NLRP3炎性小體在缺血性腦卒中的作用 缺血性腦卒中有關(guān)炎性小體的研究眾多，其中對(duì)NLRP3炎性小體的研究最為廣泛深入。目前，主流觀點(diǎn)認(rèn)為NLRP3炎性小體誘導(dǎo)急性缺血性腦卒中的神經(jīng)炎癥[15]，在腦卒中神經(jīng)元細(xì)胞死亡和行為缺陷中發(fā)揮主要作用[16]。NLRP3可產(chǎn)生眾多促炎細(xì)胞因子，介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞功能障礙和腦水腫，一旦激活最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡[14]。通過(guò)研究短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(tMCAO)小鼠模型發(fā)現(xiàn)，NLRP3缺失可保護(hù)小鼠免受缺血性腦損傷，減少梗死體積和水腫形成，保持血腦屏障(BBB)的通透性，減少炎癥反應(yīng)[17]。因此，NLRP3炎性小體被認(rèn)為是治療腦缺血再灌注時(shí)腦水腫的重要靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)顯示，NLRP3炎性小體特異性抑制劑MCC950具有抑制NLRP3炎性小體擴(kuò)大梗死區(qū)水通道蛋白4(AQP4)的表達(dá)和分布的作用[18]。

隨著NLRP3炎性小體在臨床中的應(yīng)用逐步深入，有關(guān)NLRP3炎性小體在缺血性腦卒中疾病中的激活通路和參與組成有了進(jìn)一步的研究。在缺血條件下初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元和腦組織，NF-κB和MAPK信號(hào)通路在NLRP1和NLRP3炎性小體的表達(dá)和激活中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[19]。腦卒中后炎癥誘導(dǎo)受體互相作用蛋白3(RIP3)/混合譜系激酶區(qū)域樣蛋白(MLKL)信號(hào)通路的激活，而MLKL觸發(fā)NLRP3炎性小體，另外缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)也參與了RIP3/MLKL通路，HIF-1α的表達(dá)在缺血性腦卒中后增加[20]。研究表明，布魯頓酪氨酸激酶(BTK)是NLRP3炎性小體的重要組成部分，是NLRP3炎性小體活化所必需的，并可能是缺血性腦卒中的有效治療靶點(diǎn)[21]。重組骨橋蛋白(OPN)能夠縮小大鼠缺血性梗死面積，減輕腦缺血損傷，這可能與其參與炎性小體和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥激活的抑制調(diào)節(jié)有關(guān)[22]。NLRP3炎性小體除了可作為治療靶點(diǎn)，對(duì)于急性缺血性腦卒中病人的預(yù)后同樣具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。NLRP3炎性小體是腦梗死病人早期神經(jīng)功能恢復(fù)不佳的危險(xiǎn)因素[23]。NLRP3炎性小體參與了急性缺血性腦卒中的炎癥級(jí)聯(lián)放大[24]，NLRP3炎性小體表達(dá)越高，則病人早期神經(jīng)功能恢復(fù)情況愈差。此外，NLRP3炎性小體組分基因的基因型組合CARD8 rs2043211/NLRP3 rs 10754558AT/CG，是動(dòng)脈粥樣硬化血栓型缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素[25]。NLRP3炎性小體蛋白編碼基因中的核苷酸變異可能對(duì)缺血性腦卒中有重要影響，攜帶雜合子的CARD8 rs2043211和NLRP3 rs10754558的男性患缺血性腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)更高[26]。

也有研究對(duì)于NLRP3炎性小體在缺血性腦卒中的主導(dǎo)地位提出質(zhì)疑。Sch?lwer等[27]認(rèn)為，NLRP3在缺血刺激后的炎癥反應(yīng)中起次要作用，在缺血后的吞噬作用調(diào)節(jié)中有關(guān)鍵作用。ASC以NLRP3依賴的方式在持續(xù)性炎癥的擴(kuò)散中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這可能是腦卒中復(fù)發(fā)的原因之一[28]。但Denes等[29]研究認(rèn)為，NLRC4和AIM2炎性小體參與了急性缺血性腦損傷，這與ASC有關(guān)，但NLRP3不參與。Lemarchand等[30]用抑制劑MCC950靶向NLRP3或使用敲除NLRP3的小鼠發(fā)現(xiàn)其對(duì)腦卒中引起的損傷程度沒(méi)有影響，表明NLRP3通路并沒(méi)有促進(jìn)炎癥加劇缺血性腦損傷。

2 NLRP1炎性小體

2.1 NLRP1炎性小體的結(jié)構(gòu)與組成 NLRP1炎性小體由4部分胞質(zhì)成分組成[31]：NLRP1受體、ASC(有Caspase募集域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白)、pro-Caspase-1、半胱氨酸蛋白酶-4前體和半胱氨酸蛋白酶-5前體(pro-Caspase-4和pro-Caspase-5)。NLRP1受體包含5個(gè)特征性的結(jié)構(gòu)域：N-末端PYD、中央的NACHT、LRRs、FIIND(未發(fā)現(xiàn)功能的區(qū)域)和C-末端的CARD[3]。

2.2 NLRP1炎性小體的激活機(jī)制 NLRP1炎性小體的激活形成機(jī)制主要有2種模式[31]：NLRP1受體的C-末端的CARD域在缺少調(diào)控蛋白ASD的情況下可以直接與pro-Caspase-1相互反應(yīng)；NLRP1受體的N-末端PYD域趨近與下游同型的調(diào)控蛋白ASD的PYD域進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，經(jīng)由ASD的CARD域連接于pro-Caspase-1的CARD域。

2.3 NLRP1炎性小體在缺血性腦卒中的作用 在缺血條件下的初級(jí)皮質(zhì)神經(jīng)元和腦組織中，NF-κB和MAPK信號(hào)通路為NLRP1和NLRP3炎性小體的表達(dá)和激活發(fā)揮了關(guān)鍵作用[18]。效應(yīng)分子Caspase-1是NLRP1的下游靶點(diǎn)，異丙酚通過(guò)抑制NLRP1-Caspase-1-Caspase-6的炎癥通路，在腦卒中中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[32]。研究結(jié)果顯示，MCAO大鼠的NLRP1炎性小體水平升高，包括NLRP1受體、ASC和pro-Caspase-1，誘導(dǎo)切割的Caspase-1、成熟的IL-1β和IL-18水平升高[33]。

3 AIM2炎性小體

3.1 AIM2炎性小體的結(jié)構(gòu)與組成 AIM2炎性小體是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種模式識(shí)別受體，屬于與免疫反應(yīng)相關(guān)的HIN-200(具有200氨基酸重復(fù)序列的造血干擾素誘導(dǎo)核蛋白)蛋白家族的一員，因其最先是在黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)，且由于其在黑色素瘤細(xì)胞中的表達(dá)缺失造成了細(xì)胞增殖，因此將其命名為黑色素瘤缺乏因子2炎性小體[34]。AIM2受體是PYHIN(包含PYRIN和HIN結(jié)構(gòu)域)家族成員，具有一個(gè)N端PYD和一個(gè)C端HIN結(jié)構(gòu)域，后者由一對(duì)緊密排列的寡核苷酸或寡糖組成[17]。

3.2 AIM2炎性小體的激活 研究表明，細(xì)菌激活A(yù)IM2炎性小體需要溶解胞漿中的塔拉弗朗西斯菌亞種或單核細(xì)胞增生李斯特菌等[35-36]。AIM2炎性小體是一種模式識(shí)別受體，在受到特異性信號(hào)刺激后，產(chǎn)生炎性小體復(fù)合物，進(jìn)而活化Caspase-1，活化的Caspase-1可裂解前體IL-1β和IL-18，從而導(dǎo)致IL-1β和IL-18的成熟和釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[37]。AIM2炎性小體也可能直接參與神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，培養(yǎng)的胚胎大鼠皮層神經(jīng)元在受到AIM2激活劑poly(dA：dT)的刺激時(shí)，發(fā)生了依賴于AIM2炎性小體的細(xì)胞死亡[29]。

Adamczak等[38]提出了一種AIM2炎性小體激活并焦亡神經(jīng)元的機(jī)制：AIM2炎性小體在細(xì)胞核內(nèi)聚集，經(jīng)宿主或病原DNA激活后，AIM2寡聚并激活A(yù)SC，激活細(xì)胞核內(nèi)Caspase-1；ASC從炎性小體中解離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中低聚成焦磷酸體，并激活Caspase-1，活性Caspase-1裂解炎性細(xì)胞因子，打開(kāi)泛連接蛋白-1(Pannexin-1)孔隙，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

3.3 AIM2炎性小體在缺血性腦卒中的作用 研究表明，AIM2炎性小體與腦卒中后的腦損傷有相關(guān)性[38]，AIM2可能是缺血性腦卒中潛在的治療靶點(diǎn)。急性腦梗死病人血漿AIM2表達(dá)水平越高，其神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重，腦梗死面積越大，預(yù)后更差[37]。通過(guò)建立MCAO大鼠模型和體外缺氧葡萄糖剝奪再灌注(OGD/R)處理的神經(jīng)細(xì)胞模型，表明AIM2炎性小體通過(guò)母系表達(dá)基因3(MEG3)/miR-485/AIM2軸激活腦缺血-再灌注損傷期間的Caspase-1信號(hào)參與細(xì)胞焦亡[39]。Roth等[40]研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中誘導(dǎo)表達(dá)Fas蛋白的天然配體(FasL)的單核細(xì)胞群，導(dǎo)致外部T細(xì)胞凋亡，在感測(cè)無(wú)細(xì)胞DNA之后，由AIM2依賴性IL-1β分泌驅(qū)動(dòng)。腦內(nèi)皮細(xì)胞可通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)信號(hào)通路依賴的方式抑制細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)和中性粒細(xì)胞黏附，至少部分通過(guò)調(diào)節(jié)STAT3的激活來(lái)抑制AIM2炎性小體，保護(hù)缺血性腦卒中后BBB的完整性，從而逆轉(zhuǎn)缺血誘導(dǎo)的BBB損傷[41]。

4 NLRP4炎性小體

NLRC4炎性小體介導(dǎo)缺血性卒中后的小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和焦亡[42]。通過(guò)使用嚙齒動(dòng)物腦卒中模型，發(fā)現(xiàn)NLRC4炎性小體和AIM2炎性小體造成腦損傷[29]。雖然對(duì)于NLRP4炎性小體與缺血性腦卒中的激活機(jī)制研究較少，但研究證明NLRP4炎性小體是心臟炎癥的重要負(fù)性調(diào)節(jié)因子[43]，通過(guò)TANK結(jié)合激酶1(TBK1)/干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和IκB活激酶復(fù)合物(IKK)/NF-κB信號(hào)通路負(fù)調(diào)控，其對(duì)于缺血性腦卒中的激活機(jī)制需進(jìn)行進(jìn)一步探索。

5 中藥通過(guò)干預(yù)炎性小體治療缺血性腦卒中的相關(guān)機(jī)制

中醫(yī)對(duì)于治療缺血性卒中有著一定優(yōu)勢(shì)，關(guān)于中藥治療缺血性腦卒中與炎性小體之間的相關(guān)機(jī)制已有初步探索。Arcctigenin(ARC)是牛蒡子中提取的一種苯基丙酸二芐基丁內(nèi)酯木脂素，通過(guò)激活大腦中的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)信號(hào)，抑制缺血性腦卒中誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體激活及IL-1β、IL-18分泌，減輕缺血性腦卒中誘發(fā)的神經(jīng)炎癥，提供神經(jīng)保護(hù)作用[44]。綠根皂苷元是從麥冬中提取的一種重要的甾體皂苷元，能抑制NLRP3的表達(dá)，降低OGD/r誘導(dǎo)的ROS的生成，抑制了MAPK通路，減輕腦缺血誘導(dǎo)的血腦屏障功能障礙[45]。川芎嗪是提取于中藥飲片川芎的無(wú)色針狀結(jié)晶，川芎嗪具有改善腦缺血再灌注損傷(CIRI)大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，控制梗死灶擴(kuò)大，抑制炎性因子分泌的作用[46]。大黃酚是從大黃屬植物中提取，全身給藥可有效抑制腦缺血/再灌注期間的神經(jīng)損傷和組織損傷，且呈劑量依賴性，能抑制NLRP3炎性小體的激活，對(duì)缺血性腦卒中具有保護(hù)作用[47]。紅花黃素是一種從紅花中提取的黃酮類化合物，實(shí)驗(yàn)顯示其能使含有NLRP3炎性小體信號(hào)通路的皮層NF-κB/NLR家族pyrin域失活性，并降低血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6濃度，減輕大鼠腦缺血再灌注損傷及炎癥反應(yīng)[48]。人參首烏提取物通過(guò)抑制大鼠缺血性腦卒中后Toll樣受體4(TLR4)/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路，增強(qiáng)神經(jīng)和血管再生[49]?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選丹參-紅花藥對(duì)配伍抗缺血性腦卒中的成分靶點(diǎn)、作用靶點(diǎn)，并實(shí)驗(yàn)證明該配伍能夠通過(guò)NF-κB信號(hào)通路下調(diào)NLRP3炎性小體的釋放，阻斷炎癥損傷環(huán)節(jié)，最終達(dá)到抗炎性損傷的作用[50]。片仔癀對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)元凋亡具有顯著的抑制作用，通過(guò)腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/自噬起始復(fù)合物(ULK1)信號(hào)通路增強(qiáng)自噬，減輕NLRP3炎性小體相關(guān)神經(jīng)炎癥[51]。同樣，清開(kāi)靈(QKL)通過(guò)抑制AMPK介導(dǎo)的NLRP3炎性小體的激活，緩解腦缺血再灌注損傷，抑制炎癥反應(yīng)[52]。人參、當(dāng)歸合用通過(guò)抑制NLRP3炎性小體和小膠質(zhì)細(xì)胞焦亡，對(duì)短暫性MCAO大鼠缺血性損傷起到神經(jīng)保護(hù)作用[53]。研究發(fā)現(xiàn)，在OGD條件下清腦滴丸可抑制MCAO大鼠和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)中NLRP3炎性小體的表達(dá)，可降低由NLRP3炎性小體介導(dǎo)并在MCAO大鼠中升高的炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18水平，表明其可能通過(guò)NLRP3炎性小體介導(dǎo)的機(jī)制保護(hù)神經(jīng)元[54]。

6 小 結(jié)

近年來(lái)，炎性小體與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究越來(lái)越廣泛，越來(lái)越多的炎性小體被證明與缺血性腦卒中發(fā)病關(guān)系密切，其發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性逐漸明晰，并逐步開(kāi)始靶點(diǎn)治療的研究?，F(xiàn)在已有針對(duì)單個(gè)靶點(diǎn)的研究，但對(duì)缺血性腦卒中發(fā)病后的整體生理調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的研究仍較不足。炎性小體與缺血性腦卒中發(fā)病及中醫(yī)治療缺血性腦卒中與炎性小體的機(jī)制處于初步探索階段，仍需進(jìn)一步深入研究。