張景逍,張金彪,張晗鈺,翟文燕,王曉靜
河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科,河北滄州 061000
急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)屬急性髓細(xì)胞白血病(AML),作為AML中的特殊亞型,APL患者骨髓中常見數(shù)量不等的Auer小體,其Auer小體的檢出率及總體數(shù)量也同樣大于其他類型的AML[1]。與此同時,APL患者骨髓異常早幼粒細(xì)胞發(fā)生Auer小體的概率在個體之間存在差異,引發(fā)這一現(xiàn)象的原因至今尚不清楚。因此本文對APL患者的Auer小體發(fā)生率進(jìn)行研究,結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和免疫學(xué)做出分析,結(jié)合相關(guān)臨床知識探索APL患者Auer小體發(fā)生率與其他臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián),并希望引入Auer小體發(fā)生率的概念以幫助臨床判斷患者預(yù)后。
1.1一般資料 收集2018年5月至2020年5月河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院確診的APL患者共38例,每一例患者的診斷均符合《血液病診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)》[2]中APL的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn),38例患者中男性18例、女性20例,年齡13~64歲,中位年齡41.5歲,其中PML/RARα融合基因長鏈型(L型)24例,短鏈型(S型)14例,融合基因剪接體相對表達(dá)量(PML/ABL)為3.24%~80.23%,初診白細(xì)胞計數(shù)(WBC)為0.2×109/L~107.5×109/L、血紅蛋白(Hb)為48~129 g/L、血小板計數(shù)(PLT)為6×109/L~122×109/L,異常細(xì)胞群流式表達(dá)率:CD13為48.41%~99.6%、CD33為77.9%~99.68%、CD117為38.70%~96.10%、CD38為13.20%~99.31%、CD64為10.66%~93.18%、CD56為0.00%~80.01%(陽性率15.8%)、HLA-DR為0.00%~33.00%(陽性率26.3%)。將患者按照不同PML/RARα融合基因類型(L型和S型)、CD56(陰性組和陽性組)、HLA-DR(陰性組和陽性組)、性別(男/女)、年齡(1組為50歲及50歲以下;2組為50歲以上)進(jìn)行分組。
1.2儀器與試劑 Olympus CX31顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社);瑞氏-吉姆薩復(fù)合染液:試劑A,瑞氏-吉姆薩染液(北京雷根生物技術(shù)有限公司);試劑B,磷酸鹽緩沖液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)。
1.3方法
1.3.1骨髓涂片制備 選擇臨床采集標(biāo)本中薄厚均勻的骨髓涂片進(jìn)行瑞氏染色,A液覆蓋標(biāo)本膜,靜置5 min后加入B液混勻,A液與B液比例約2∶1,靜置45 min,自然風(fēng)干。
1.3.2Auer小體發(fā)生率計數(shù) 取38例患者骨髓涂片鏡下觀察,4名骨髓形態(tài)學(xué)檢測人員每人在油鏡下不同部位分別觀察500個異常早幼粒細(xì)胞,計數(shù)發(fā)生了Auer小體的細(xì)胞比例,求得平均值作為患者Auer小體發(fā)生率,38例標(biāo)本最終計數(shù)結(jié)果為0.00%~29.25%,中位數(shù)為1.00%。
1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入與整理,運(yùn)用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析;不符合正態(tài)分布的計量資料用M(P25,P75)表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān);采用簡單線性回歸對Auer小體發(fā)生率的影響因素進(jìn)行單因素分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1不同臨床資料患者Auer小體發(fā)生率的差異性分析 不同性別、年齡、HLA-DR表達(dá)的患者Auer小體發(fā)生率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),不同CD56表達(dá)、PML/RARα融合基因類型的患者Auer小體發(fā)生率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其中CD56陰性組的Auer小體發(fā)生率高于陽性組(P<0.05),L型PML/RARα融合基因的Auer小體發(fā)生率高于S型(P<0.05),見表1。
表1 不同患者Auer小體發(fā)生率的差異性分析[M(P25,P75)]
2.2各項指標(biāo)與Auer小體發(fā)生率的相關(guān)性分析 將患者初診WBC、各項流式表達(dá)率(CD13、CD33、CD117、CD64、CD38)、PML/ABL、Hb、PLT共9項指標(biāo)分別和Auer小體發(fā)生率做相關(guān)性分析,結(jié)果顯示僅WBC與Auer小體發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),r為-0.376,見表2。
表2 各項指標(biāo)與Auer小體發(fā)生率的相關(guān)性分析結(jié)果
2.3影響Auer小體發(fā)生率的單因素回歸分析 將Auer小體發(fā)生率作為因變量,相關(guān)性分析中有統(tǒng)計學(xué)意義的指標(biāo)(WBC)作為自變量進(jìn)行簡單線性回歸分析。結(jié)果顯示,WBC進(jìn)入了回歸方程,回歸模型有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),可認(rèn)為初診WBC是Auer小體發(fā)生率的影響因素,回歸方程為:Y=-0.001X+0.079,說明WBC每增加一個單位,整體樣本的Auer小體發(fā)生率平均降低0.1%,見表3。
表3 影響Auer小體發(fā)生率的單因素回歸分析
Auer小體于1906年由美國醫(yī)師John Auer首先發(fā)現(xiàn),日常工作中常見由嗜苯胺藍(lán)顆粒融合而成的桿狀A(yù)uer小體,此外還可見呈針尖狀或卵圓狀等形狀的Auer小體[3],在骨髓形態(tài)學(xué)中Auer小體的出現(xiàn)標(biāo)志著該細(xì)胞起源于白血病的克隆,可見于AML患者中的原始和幼稚細(xì)胞,其在AML中有較高的特異性[4]。自Auer小體被發(fā)現(xiàn)以來,在早期HASSAN等[5]認(rèn)為Auer小體的出現(xiàn)是白血病預(yù)后較好的重要指標(biāo),但近年來我國學(xué)者胡忠利等[6]研究的結(jié)論表明,Auer小體的出現(xiàn)與AML患者預(yù)后無關(guān),學(xué)者們對此的結(jié)論并不完全一致,目前為止,Auer小體的陽性對臨床的幫助也僅限于對骨髓增生異常綜合征(MDS)分型的判斷,其對臨床的指導(dǎo)意義尚未被完全發(fā)掘。
APL患者中的異常早幼粒細(xì)胞通常全部表達(dá)CD123、CD13、CD33、CD38和CD64,約96%的患者表達(dá)CD117和CD9,CD15、CD56和CD11b陽性率分別為37.1%、24.7%和20.0%,CD34和HLA-DR的陽性率分別為10.7%和7.0%[7]。本研究將陽性率100.0%的抗原與Auer小體發(fā)生率做相關(guān)性分析,結(jié)果顯示,與Auer小體發(fā)生率均不存在相關(guān)性(P>0.05),其他抗原中HLA-DR的表達(dá)與Auer小體發(fā)生率無關(guān)(P>0.05),但CD56陰性的APL患者Auer小體發(fā)生率高于CD56陽性患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。白血病細(xì)胞CD56抗原屬于超免疫球蛋白之一,是人類天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分,其不但介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用,還可能參與細(xì)胞介導(dǎo)的毒性反應(yīng)[8],在AML中CD56可作為判斷患者預(yù)后的指標(biāo)之一,CD56陽性的APL患者盡管總體存活期與陰性患者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但緩解持續(xù)時間和無病生存期更短,預(yù)后、療效更差[9]。本研究雖得到了CD56陰性的APL患者Auer小體發(fā)生率高于CD56陽性患者的結(jié)論,但在實(shí)際工作中只收集到了患者白血病細(xì)胞群的CD56表達(dá)率,未收集到患者CD56陽性細(xì)胞群CD56的表達(dá)強(qiáng)度,因此APL患者中Auer小體的發(fā)生率是否受CD56表達(dá)強(qiáng)度的影響還需進(jìn)一步探索。
APL特征性的遺傳改變?yōu)閠(15;17),存在早幼粒細(xì)胞白血病α融合基因,PML/RARα融合基因分為3種亞型,即長鏈型(L型;bcr1)、變異型(V型;bcr2)與短鏈型(S型;bcr3),其中L型異常早幼粒細(xì)胞形態(tài)多為典型多顆粒型且免疫表型多為典型APL特點(diǎn),S型無明顯特殊性,但V型異常早幼粒細(xì)胞形態(tài)多為細(xì)顆粒型,部分患者會表達(dá)CD34[10]。本次對L型和S型融合基因的差異性研究發(fā)現(xiàn),L型融合基因的APL患者Auer小體發(fā)生率高于S型患者,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),其原因可能是由于某一種基因序列在L型患者中的重復(fù)性不同于S型,從而導(dǎo)致Auer小體多發(fā),此假設(shè)還需進(jìn)一步驗(yàn)證。
APL患者初診的WBC、Hb、PLT是臨床判斷患者危險程度的指標(biāo),根據(jù)APL診療指南中的危險分層標(biāo)準(zhǔn)將初診WBC<10×109/L且PLT>40×109/L的患者分為低危組;WBC≤10×109/L且PLT≤40×109/L的患者分為中危組;WBC>10×109/L的患者分為高危組[11],本研究顯示Hb與PLT兩項指標(biāo)與患者Auer小體發(fā)生率均無相關(guān)性,但初診WBC與Auer小體發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05),r為-0.376,同時將WBC引入線性回歸分析中得出回歸方程為:Y=-0.001X+0.079,本研究可得出WBC與Auer小體發(fā)生率呈負(fù)相關(guān),但是因樣本量較小,還需更大的樣本量對回歸方程進(jìn)行修正。
綜上所述,本研究中與APL患者Auer小體發(fā)生率有關(guān)的因素分別為CD56的表達(dá)、初診WBC與PML/RARα融合基因類型,CD56陰性患者Auer小體發(fā)生率高于陽性患者;PML/RARα融合基因L型患者Auer小體發(fā)生率高于S型患者;WBC越低Auer小體的發(fā)生率越高。既往有研究表明,S型融合基因患者的預(yù)后較L型更差[12],CD56陽性的APL患者預(yù)后不良[13];也有研究表明,初診WBC高的患者較WBC低的患者預(yù)后不良[14]。本研究結(jié)果顯示,一般情況下APL患者Auer小體發(fā)生率低提示預(yù)后不良,具體生存曲線分析及如何劃分Auer小體發(fā)生率的界限來判斷患者預(yù)后還需進(jìn)一步研究。APL患者的初診Auer小體發(fā)生率有望作為評估臨床其他指標(biāo)與患者預(yù)后的參考指標(biāo)。