馬佳 彭獻 何樨

【摘要】目的：調(diào)查孤獨癥譜系障礙 ASD 患兒腸道菌群失衡、免疫指標紊亂情況，并分析其相關性，為臨床解釋 ASD 病因機制提供可靠依據(jù)。方法：選取2017年6月至2020年6月期間于我院門診確診的82例 ASD 患兒為觀察組，并隨機選取同期接受健康體檢57例兒童作為健康對照組，采集兩組兒童糞便，通過熒光定量 PCR 法測定其腸道菌群多樣性，定量檢測并計算其雙歧桿菌屬細菌數(shù)量與腸桿菌科細菌數(shù)量對數(shù)值比值 B/E 值，比較兩組兒童腸道菌群數(shù)量、B/E 值及免疫指標（白細胞介素-5）IL-5、巨噬細胞炎性蛋白1α（MIP-1α）、調(diào)節(jié)性 T 細胞（Treg）、促炎輔助性 T 細胞17型 （Th17）、Treg/Th17水平，并通過 Pearson 積矩相關分析評估 ASD 患兒 B/E 值與 IL-5、MIP-1α、Treg、Th17、Treg/ Th17指標間相關性。結果：兩組對象性別、年齡、母親文化水平、孕期抗生素使用比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05），兩組父親文化水平、分娩方式、新生兒窒息資料比較有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;觀察組大腸埃希菌、雙歧桿菌數(shù)量及 B/E 值明顯低于健康對照組（P<0.05），兩組腸球菌、乳酸桿菌數(shù)量比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;觀察組 MIP-1α、Treg、Treg/ Th17明顯低于健康對照組（P<0.05），而 IL-5、Th17明顯高于健康對照組（P<0.05）;經(jīng) Pearson 相關分析，ASD 患兒B/E 值與 IL-5、MIP-1α均無相關性（P>0.05），與 Treg、Treg/Th17均具有正相關性（P<0.05），與 Th17具有負相關（P<0.05）。結論： ASD 患兒體內(nèi)確存在腸道菌群失衡情況，并伴隨著免疫指標紊亂，且兩者具有一定相關性。

【關鍵詞】孤獨癥譜系障礙;現(xiàn)狀調(diào)查;相關因素;免疫指標;腸道菌群

[中圖分類號]R574;R749.94 [文獻標識碼]A[文章編號]2096-5249（2022）01-0081-04

Investigation and relationship analysis of intestinal flora imbalance and immune index disorder in children with ASD

MA Jia， PENG Xian， HE Xi （Department ofPreventionandProtection， Futian Second People’s Hospital， Shenzhen Guangzhou 518049，China）

[Abstract] Objective： To investigate the imbalance of intestinal flora and disorder of immune indexes in children with ASD in autism spectrum disorder， and analyze their correlation， so as to provide reliable basis for clinical explanation of the etiology and mechanism of ASD. Methods： Eighty-two children with ASD diagnosed in the outpatient department of our hospital from June 2017 to June 2020 were selected as the observation group， and 57 children who received physical examination at the same time were randomly selected as the healthy control group. The feces of the two groups of children were collected， the diversity of intestinal flora was determined by fluorescence quantitative PCR， and the ratio of the number of Bifidobacterium bacteria to the number of Enterobacteriaceae bacteria was quantitatively detected and calculated by B/E value. The intestinal microflora， B/E value and immune indexes （Interleukin -5） IL-5， macrophage inflammatory protein 1α（MIP-1α）， regulatory T cells （Treg）， pro-inflammatory helper T cells type 17（Th17）， Treg/Th17 were compared between the two groups， and the B/ T ratio of children with ASD was evaluated by Pearson product moment correlation analysis. Results： There was no significant difference in sex， age， mother’s educational level and antibiotic use during pregnancy between the two groups （P>0.05）， but there was significant difference in father’s educational level， mode of delivery and neonatal asphyxia between the two groups （P<0.05）. The number and B/E value of Escherichia coli and Bifidobacterium in observation group were significantly lower than those in healthy control group （P<0.05）， but there was no significant difference in the number of enterococcus and lactobacillus between the two groups （P>0.05）. MIP-1α， Treg and Treg/Th17 in the observation group were significantly lower than those in the healthy control group （P<0.05）， while IL-5 and Th17 were significantly higher than those in the healthy control group （P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that the B/E value of ASD children was not correlated with IL-5 and MIP-1α（P>0.05）， but positively correlated with Treg and Treg/Th17（P<0.05） and negatively correlated with Th17（P<0.05）. Conclusion： There is an imbalance of intestinal flora in children with ASD， accompanied by disorder of immune indexes， and there is a certain correlation between them.

[Key words] Autism spectrum disorder; Current situation investigation; Related factors; Immune indicators; Intestinal flora

孤獨癥譜系障礙（Autistic Spectrum Disorder， ASD）屬于臨床廣泛意義上孤獨癥，不僅包含典型孤獨癥，還包含不典型孤獨癥及以阿斯伯格綜合癥為代表疑似癥狀，與自閉癥同義，是一組以社交溝通障礙、興趣或活動范圍狹窄以及重復刻板行為主要特征神經(jīng)發(fā)育障礙[1]。目前，臨床針對 ASD 患兒發(fā)病機制及危險因素尚無統(tǒng)一定論，可能與遺傳學、免疫、生化、孕產(chǎn)期等因素有關[2]。以往研究針對ASD 患兒腸道微生物多樣性調(diào)查報道較多，但對其與免疫系統(tǒng)相互影響機制尚未明確，本研究選取臨床較為常見免疫指標，旨在探究 ASD 患兒腸道菌群失衡、免疫指標紊亂情況，并分析其相關性，為相關部門制定ASD 預防、監(jiān)測、康復等方面政策提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象選取2017年6月至2020年6月期間于我院門診確診82例 ASD 患兒為觀察組，年齡1～6歲，平均年齡（3.23±1.32）歲，納入標準：符合美國精神病學會發(fā)布精神疾病診斷統(tǒng)計手冊第五版[3]中 ASD 診斷標準者;孤獨癥兒童行為量表 ABC ≥67分者;初次確診為 ASD 者;患兒及其家屬知情同意，并主動提出簽署知情同意書。排除標準：聽力障礙、腦部發(fā)育障礙者;合并脆性 X 綜合征、精神發(fā)育異常、阿思伯格綜合征等精神疾病者;神經(jīng)發(fā)育遲緩無法完成調(diào)查者;合并先天性疾病者;近期存在急性或慢性感染史者。并隨機選取同期接受健康體檢57例兒童作為健康對照組，本次研究得到醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1調(diào)查方法采用 ABC 量表進行初次篩選，該量表適用于18個月～28歲人群，可歸納為感覺、交往、軀體運動、語言、生活自理五個維度，共57 個條目，總分為158分，將得分≥67分患兒歸為可疑患兒，并參照精神疾病診斷統(tǒng)計手冊第五版診斷標準確診。由我院兒童心理衛(wèi)生科自編背景問卷發(fā)放調(diào)查，由其主要監(jiān)護人進行填寫。

1.2.2腸道菌群多樣性檢測方法所有兒童均于入院當天收集其新鮮糞便標本5 g，放于含有保存液培養(yǎng)盒中，并置于-80℃冰箱內(nèi)保存。通過QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit/Qiagen 糞便 DNA 快速提取試劑盒德國凱杰 QIAGEN 公司提取樣本核酸，并進行濃度、純度等分析，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行完整性質(zhì)檢。對提取完整核酸進行目的片段16 S rDNA V3 V4 d 的 PCR 擴增，其引物基因序列見表1。以擴增產(chǎn)物為模板，通過 Illumina MiSeq測序文庫進行標簽序列添加，全部產(chǎn)物采用Axygen DNA 凝膠回收試劑盒 AP-GX-50愛思進生物技術有限公司進行回收，實時 PCR 進行熒光定量分析，均一混合后完成文庫制備，利用 PE300測序系統(tǒng)進行高通量測序。

1.2.3免疫指標檢測方法于清晨空腹下行常規(guī)靜脈采血5 mL 置于抗凝管，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞 PBMC，并制備血漿，以3000 r/min 離心血樣10 min，提取血清并于 -70℃條件下保存待測;通過CytoFLEX LX 流式細胞儀貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司檢測輔助性 T 細胞、調(diào)節(jié)性 T 細胞水平。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒上海臻科生物科技有限公司測定患兒白細胞介素-5、巨噬細胞炎性蛋白1 α水平，所有試劑盒操作均嚴格按照試劑盒自帶說明書進行。

1.3觀察指標比較兩組兒童腸道菌群數(shù)量、 B/E 值及免疫指標 IL-5、MIP -1 α、Treg、Th17、 Treg/Th17水平，并通過 Pearson 積矩相關分析評估ASD 患兒 B/E 值與 IL-5、MIP -1 α、Treg、Th17、 Treg/Th17指標間相關性。

1.4統(tǒng)計學方法采用 SPSS18.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以率%表示，組間對比進行χ2檢驗，計量資料用x ±s 表示，多組間采用單因素方差分析，統(tǒng)計學有意義結果進一步采用 SNK-q 檢驗;相關性采用 Pearson 分析法，以P<0.05時為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1兩組一般資料比較選取2017年6月至2020年6月期間于我院門診確診82例 ASD 患兒為觀察組，另選57例患兒為健康對照組，其兩組一般資料對比如表2所示。

2.2兩組腸道微生物多樣性比較觀察組大腸埃希菌、雙歧桿菌數(shù)量及 B/E 值明顯低于健康對照組（P<0.05），兩組腸球菌、乳酸桿菌數(shù)量比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05），詳見表3。

2.3兩組免疫指標比較觀察組 MIP -1 α、 Treg、Treg/Th17明顯低于健康對照組（P<0.05），而IL -5、Th17明顯高于健康對照組（P<0.05），詳見表4。

2.4 ASD 患兒 B/E 值與 IL-5、MIP-1α、Treg、 Th17、Treg/Th17相關性分析經(jīng) Pearson 相關分析，ASD 患兒 B/E 值與 IL -5、MIP -1α均無相關性（P>0.05），與 Treg、Treg/Th17均具有正相關性（P<0.05），與 Th17具有負相關（P<0.05），詳見表5。

3 討論

孤獨癥概念由利奧·凱納Kanner·L教授首次提出，隨后得到廣泛關注與報道，在2013年5月精神疾病診斷統(tǒng)計手冊第五版中最終確立 ASD 定義，使該病介紹更加普及[4]。

以往研究表明，ASD 屬于一種因神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)而引發(fā)發(fā)育障礙，其臨床多伴隨胃腸道問題及免疫功能紊亂，臨床針對 ASD 患兒微生物數(shù)量及其多樣性調(diào)查較多，但與免疫功能指標關系報道較少。本研究通過調(diào)查 ASD 患兒與健康同齡兒童腸道菌群失衡情況，結果顯示，觀察組大腸埃希菌、雙歧桿菌數(shù)量及 B/E 值明顯低于健康對照組，提示 ASD 患兒發(fā)病確伴有腸道菌群失調(diào)狀況，分析原因，腦-腸-菌軸作為胃腸道與神經(jīng)系統(tǒng)間聯(lián)系，主要涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)、腸道菌群、腸神經(jīng)系統(tǒng)等，其中神經(jīng)系統(tǒng)可通過信號傳導等對腸道發(fā)揮抑制作用，而過度激活則會導致腸道運動障礙，并影響其分泌功能。腸道菌群與 ASD 確有關聯(lián)，但具體作用機制尚不清楚。

王琳等[5]還發(fā)現(xiàn)，ASD 兒童存在明顯神經(jīng)免疫異常，表現(xiàn)出骨橋蛋白及白介素17A 水平異常升高。本研究選取較為常見幾類指標，其中 MIP-1α屬于CC 類趨化因子，主要通過趨化 T 淋巴細胞等在炎癥區(qū)域或腫瘤部位發(fā)揮促炎作用。IL-5主要由抗原活化 CD4+T 細胞產(chǎn)生，并具有誘導 B 細胞及嗜酸性粒細胞分化、促進細胞毒 T 細胞生成等作用[6]。Th17細胞因子與 Treg 細胞因子之間表現(xiàn)為功能相互拮抗關系，在 ASD 疾病發(fā)展中，Th17呈現(xiàn)出強促炎、誘導自身免疫疾病作用，Treg 則表現(xiàn)為抗炎、調(diào)控免疫應答作用[7]。研究結果顯示，觀察組 MIP -1α、 Treg、Treg/Th17明顯低于健康對照組，而 IL -5、 Th17明顯高于健康對照組，表明 ASD 患兒存在一定免疫障礙。Th17及其相關細胞因子數(shù)量占優(yōu)勢，表明 ASD 患兒全身或局部免疫應答異常。結果中 ASD患兒表現(xiàn)出 MIP-1α水平降低，與以往部分研究結果不符，可能是因為納入標準不一樣所致[8]。該結果產(chǎn)生可能與其代謝產(chǎn)物的抗炎作用降低有關，進而引發(fā)免疫耐受異常，另外，ASD 患兒腸粘膜損傷，增加細菌、大分子抗原等入侵風險，出現(xiàn)局部炎癥反應，影響其免疫功能紊亂。

綜上所述，ASD 患兒體內(nèi)確存在腸道菌群失衡情況，并伴隨著免疫指標紊亂，且兩者具有一定相關性。

參考文獻

[1] 趙英欣 ， 張旭靜 ， 鄭毅 . 腸道微生物 - 大腦軸與孤獨癥譜系障礙 [J]. 中華精神科雜志 ， 2019， 52（3）： 224-227.

[2] 王琳 ， 楊曉蕾 ， 馬永娟 ， 等 . 神經(jīng)免疫指標與孤獨癥譜系障礙的關聯(lián) [J]. 中國學校衛(wèi)生 ， 2019， 40（4）： 499-502.

[3] 王雷 ， 趙會君 ， 羅茜 ， 等 . 不同碳水化合物對孤獨癥患兒腸道菌群體外發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸的影響 [J]. 中國微生態(tài)學雜志 ， 2019， 31（5）： 512-518.

[4] 張靜 ， 王凱旋 ， 盛放 ， 等 . 維生素 D 對孤獨癥譜系障礙兒童血清 25（OH）D 水平腸道癥狀及腸道菌群失調(diào)的影響[J]. 中國婦幼保健 ， 2020， 35（23）： 4493-4495.

[5] 王琳 ， 楊曉蕾 ， 馬永娟 ， 等 . 神經(jīng)免疫指標與孤獨癥譜系障礙的關聯(lián) [J]. 中國學校衛(wèi)生 ， 2019， 40（4）： 499-502.

[6] 肖鴿飛 ， 周翔 ， 李樺 ， 等 . 炎性細胞因子與孤獨癥譜系障礙兒童精神發(fā)育的相關性分析 [J]. 中國兒童保健雜志 ， 2018， 26（7）： 778-780.

[7] 汪鴻 ， 王小燕 ， 吳梅榮 ， 等 . 孤獨癥譜系障礙兒童外周血淀粉酶樣前體蛋白及腦源性生長因子的特異性研究 [J]. 中國兒童保健雜志 ， 2018， 26（10）： 95-98.

[8] 肖鴿飛 ， 周翔 ， 李樺 ， 等 . 炎性細胞因子與孤獨癥譜系障礙兒童精神發(fā)育的相關性分析 [J]. 中國兒童保健雜志 ， 2018， 26（7）： 778-780.

作者簡介：馬佳，大學本科，副主任醫(yī)師，研究方向：兒童保健學。

（ 收稿日期：2021-6-21 接受日期：2021-8-12）