◎ 楊 琳，王 震

（諾安實(shí)力可商品檢驗(yàn)（上海）有限公司，上海 201112）

食物過(guò)敏是由人體免疫系統(tǒng)對(duì)食物中特定蛋白質(zhì)的反應(yīng)引起的敏感性。目前有＞6%的幼兒和3%～4%的成年人存在食物過(guò)敏現(xiàn)象。在過(guò)敏的個(gè)體中，特定的食物蛋白質(zhì)會(huì)被免疫系統(tǒng)誤認(rèn)為是有害的，當(dāng)過(guò)敏個(gè)體第一次接觸到這種蛋白質(zhì)時(shí)，身體的免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生稱(chēng)為免疫球蛋白E（IgE）的抗體，當(dāng)過(guò)敏個(gè)體再次暴露于相同的食物蛋白質(zhì)時(shí)，IgE抗體和化學(xué)物質(zhì)（如組胺）就會(huì)釋放出來(lái)。組胺是一種強(qiáng)大的化學(xué)物質(zhì)，可引起呼吸系統(tǒng)、胃腸道、皮膚或心血管系統(tǒng)的反應(yīng)。在極端情況下，食物過(guò)敏甚至可能致命。盡管任何食物都能激發(fā)過(guò)敏個(gè)體的免疫反應(yīng)，但只有少數(shù)食物是導(dǎo)致食物過(guò)敏的原因。

近幾年的普查結(jié)果顯示我國(guó)的乳糜瀉發(fā)生率為1‰～3‰，而歐洲人和澳洲人乳糜瀉的發(fā)生率則更高，為3‰～4‰。導(dǎo)致乳糜瀉的主要原因是長(zhǎng)期食用含麩質(zhì)的谷物，包括小麥、黑麥、大麥、燕麥、斯佩爾特小麥、卡姆小麥或其雜交品系及其制品。因此食品制造商通過(guò)在產(chǎn)品上清楚地貼上成分清單來(lái)保護(hù)那些對(duì)食品過(guò)敏的人。這個(gè)在歐洲食品標(biāo)示中為強(qiáng)制規(guī)定，澳洲相關(guān)法規(guī)更是規(guī)定麩質(zhì)含量大于＞20 mg·kg-1的食品，必須強(qiáng)制在食品上申明[1-2]。所以過(guò)敏原的檢測(cè)可確保食品制造商在制造之前及期間，具有潛在危險(xiǎn)的過(guò)敏成分不會(huì)進(jìn)入食品中。

現(xiàn)階段過(guò)敏原的檢測(cè)有酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）、側(cè)向流動(dòng)（Lateral Flow Testing，LFT）、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）和液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）幾種方法。其中LC-MS/MS設(shè)備相對(duì)昂貴；與ELISA相比，PCR的主要缺點(diǎn)是不針對(duì)過(guò)敏蛋白，針對(duì)DNA，而DNA的檢測(cè)并不意味著過(guò)敏蛋白的存在，且PCR只能定性測(cè)試，無(wú)法進(jìn)行定量測(cè)試；側(cè)向流動(dòng)僅為定性測(cè)試。因此首選以及最常用的方法是用ELISA檢測(cè)。

本文使用酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）的方法測(cè)試麩質(zhì)過(guò)敏原。實(shí)驗(yàn)選用大豆分離蛋白、薯?xiàng)l、淋洗水為樣品，測(cè)定樣品空白，同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)品在線(xiàn)性最低點(diǎn)、中間點(diǎn)濃度對(duì)以上3個(gè)樣品進(jìn)行3平行加標(biāo)并重復(fù)2天測(cè)試，以驗(yàn)證測(cè)試的定量限、重復(fù)性和重現(xiàn)性，以確認(rèn)該方法的可行性。同時(shí)用線(xiàn)性最低點(diǎn)濃度加標(biāo)的樣品含量對(duì)于整體的測(cè)試進(jìn)行不確定度評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

麩質(zhì)有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，購(gòu)自Sigma-Aldrich，CAS號(hào)為8002-80-0，純度85%；麩質(zhì)過(guò)敏原試劑盒，購(gòu)自Biofront，型號(hào)為MonoTrace Glu-EK-96；純凈水，購(gòu)自哇哈哈純凈水；無(wú)水乙醇，色譜純，購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

本實(shí)驗(yàn)用到的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備見(jiàn)表1。

1.3 測(cè)試流程

稱(chēng)取0.25 g經(jīng)過(guò)充分研磨的食品樣品或0.25 mL液體樣品到聚丙烯離心管中。向試樣中加入10 mL預(yù)熱的萃取緩沖液（60%乙醇、焦亞硫酸鈉和谷胱甘肽），并短暫渦旋使其懸浮混勻。將裝有試樣的試管在60 ℃下培養(yǎng)試管1 h，每隔15 min劇烈振搖一次，以提取樣品中的蛋白質(zhì)。將試樣在室溫下以2 000g離心10 min，并用樣品稀釋劑將樣品提取液稀釋10倍。取200 μL稀釋過(guò)的樣品提取液和標(biāo)準(zhǔn)品添加到相應(yīng)的孔中，使樣品中的麩質(zhì)抗原與包被在試劑盒微孔板中的多克隆抗體結(jié)合，并在孔中形成抗原-抗體復(fù)合物。在22 ℃孵育10 min。小心倒出測(cè)試條孔中的液體，在吸水紙上拍打至干。用洗滌緩沖液清洗3次，并每次拍打吸干，以清洗去除未結(jié)合的麩質(zhì)抗原。向每個(gè)孔中添加100 μL抗麩質(zhì)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）。將其置于避光環(huán)境中，22 ℃孵育10 min，此時(shí)酶與已形成的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗體-抗原-抗體夾心。小心將測(cè)試條孔中液體倒出，清洗并拍打吸干，去除多余的結(jié)合抗體。每孔添加100 μL高靈敏度3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物后，22 ℃避光孵育10 min，向每個(gè)孔中添加100 μL反應(yīng)終止液，輕輕振搖進(jìn)行混合，以防止產(chǎn)生氣泡干擾吸光度讀數(shù)。由于復(fù)合物上結(jié)合了酶，導(dǎo)致酶底物的加入后有顏色的產(chǎn)生，且顏色的強(qiáng)度與食物中麩質(zhì)的濃度成正比，所以使用裝有吸光度在450 nm的酶標(biāo)儀讀取微孔的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[3]。

1.4 實(shí)驗(yàn)測(cè)量方法與數(shù)學(xué)模型

實(shí)驗(yàn)測(cè)量方法為稱(chēng)樣→提取→孵育→離心→稀釋→孵育→洗板→加麩質(zhì)抗體共軛物→孵育→洗板→加底物→孵育→加終止液→讀數(shù)。被測(cè)量的數(shù)學(xué)模型：

式中：X為試樣中麩質(zhì)過(guò)敏原的含量，mg·kg-1；C為測(cè)定用試樣液中麩質(zhì)過(guò)敏原的濃度，μg·mL-1；M為試樣質(zhì)量，g；V為試樣的最后定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)性范圍與數(shù)據(jù)結(jié)果

取大豆分離蛋白、薯?xiàng)l、淋洗水空白基質(zhì)樣品，取3份不加入標(biāo)準(zhǔn)品直接測(cè)試，通過(guò)3 d對(duì)空白基質(zhì)的測(cè)定，得到的結(jié)果均為0 mg·kg-1，基質(zhì)樣品中的數(shù)值均＜檢出限的1/3，表明基質(zhì)對(duì)加標(biāo)沒(méi)有干擾，這3種基質(zhì)與試劑盒之間沒(méi)有交叉反應(yīng)。另取樣品分別于每份樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍低、中濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各3份后，重復(fù)2 d，按照1.3的試驗(yàn)步驟測(cè)試，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線(xiàn)見(jiàn)圖1，基質(zhì)加標(biāo)數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

以標(biāo)樣的濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，從儀器讀取450 nm的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作三次曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)工作三次曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)在2～100 μg·mL-1為R2=1，見(jiàn)圖1，滿(mǎn)足＞0.995的要求，說(shuō)明線(xiàn)性在該定量范圍內(nèi)符合標(biāo)準(zhǔn)要求[4]。各個(gè)基質(zhì)最低加標(biāo)水平2 mg·kg-1均能夠同時(shí)滿(mǎn)足精密度和準(zhǔn)確度的要求，所以加標(biāo)最低點(diǎn)2 mg·kg-1即為此次驗(yàn)證的定量限，同時(shí)該定量限也完全能滿(mǎn)足20 mg·kg-1的歐盟相關(guān)法規(guī)要求。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)曲線(xiàn)圖

通過(guò)2個(gè)濃度點(diǎn)的基質(zhì)加標(biāo)并測(cè)試2 d，計(jì)算得出2 d測(cè)試的結(jié)果，并計(jì)算其回收率，同時(shí)對(duì)方法的準(zhǔn)確度、重復(fù)性與重現(xiàn)性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表2。發(fā)現(xiàn)不同濃度水平的回收率均能滿(mǎn)足70%～120%的要求，證明其準(zhǔn)確度符合標(biāo)準(zhǔn)要求；基質(zhì)2個(gè)加標(biāo)水平的回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿(mǎn)足＜20%的要求，證明其重復(fù)性及重現(xiàn)性符合標(biāo)準(zhǔn)要求[4]。

表2 基質(zhì)加標(biāo)數(shù)據(jù)表

2.2 不確定度的來(lái)源的確定和分析

2.2.1 A類(lèi)不確定度的來(lái)源

取大豆分離蛋白基質(zhì)的最低點(diǎn)加標(biāo)的6個(gè)平行測(cè)定結(jié)果計(jì)算麩質(zhì)過(guò)敏原含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(X)。6 次的結(jié)果分別為 1.8 mg·kg-1、1.9 mg·kg-1、1.8 mg·kg-1、2.3 mg·kg-1、2.1 mg·kg-1和 2.3 mg·kg-1，平均值為 2.03 mg·kg-1[5-6]。

麩質(zhì)過(guò)敏原含量測(cè)定重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

麩質(zhì)過(guò)敏原含量測(cè)定重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.2 B類(lèi)不確定度來(lái)源

（1）樣品稱(chēng)量m引起的不確定度urel(M)。用萬(wàn)分之一電子天平進(jìn)行樣品的稱(chēng)量，其分度值為0.1 mg，取均勻分布，包含因子則可讀性的不確定度為天平校正產(chǎn)生的不確定度，按檢定證書(shū)給出的稱(chēng)量誤差為±0.3 mg，假設(shè)為均勻分布，

由此2項(xiàng)合成得出稱(chēng)量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

得出稱(chēng)量引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(M)=u(M)/0.25 g=7.28×10-4。

（2）10 mL移液器移取提取液引起的不確定度urel(V)。樣品提取時(shí)加入10 mL提取液。移液器的不確定度來(lái)源于移液器產(chǎn)生的不確定度u(V1)和溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度u(T)。

移液器產(chǎn)生的不確定度：10 mL移液器，其不確定度由SIMT校定給出擴(kuò)展不確定度U=12 μL，k=2；標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(V1)=U/k=6 μL。

溫度效應(yīng)產(chǎn)生的不確定度：移液器一般在20 ℃下被校準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境溫度一般為（20±5）℃，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，按矩形分布10 mL移液器由溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為u(T)=10 000×5×2.1×10-4/則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（3）配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引起的不確定度urel(std)。制備工作曲線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用了1 000 μL移液槍。1 000 μL移液槍的擴(kuò)展不確定度U=3.5 μL，k=2；按矩形分布，溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1 000×5×2.1×

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）測(cè)試用樣液體積引起的不確定度urel(V2)。吸取100 μL樣品提取液上機(jī)測(cè)試。使用100 μL移液槍?zhuān)鋽U(kuò)展不確定度U=0.6 μL，k=2；按矩形分布，溫度效應(yīng)引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為100×5×2.1×10-4/

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）酶標(biāo)儀引入的不確定度urel(A)。由校準(zhǔn)證書(shū)給出儀器擴(kuò)展不確定度為吸光度U=0.06（k=2），則相對(duì)不確定度為urel(A)=0.06/2=0.03。

（6）孵育時(shí)間引入的不確定度urel(T)。實(shí)驗(yàn)中共孵育3次，孵育時(shí)間均為10 min。已校準(zhǔn)過(guò)的計(jì)時(shí)器擴(kuò)展不確定度為U=1 s（k=2），則由溫育時(shí)間引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（7）孵育溫度引入的不確定度urel(W)。實(shí)驗(yàn)中共孵育3次，孵育溫度均為22 ℃。已校準(zhǔn)過(guò)的孵育箱擴(kuò)展不確定度為U=0.4 ℃（k=2），則由溫育溫度引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.3 計(jì)算合成相對(duì)不確定度urel(X)

合成相對(duì)不確定度urel(X)為：

2.2.4 計(jì)算擴(kuò)展不確定度

在95%的置信概率下時(shí)，擴(kuò)展因子k=2，則大豆分離蛋白中的麩質(zhì)過(guò)敏原含量的擴(kuò)展不確定度為U=2×0.058 7=11.7%。則麩質(zhì)過(guò)敏原含量的測(cè)定結(jié)果可以表述為X=（2±0.234）mg·kg-1（k=2）。

2.3 不確定度評(píng)估

選取大豆分離蛋白基質(zhì)的最低點(diǎn)加標(biāo)數(shù)據(jù)作為A類(lèi)不確定度的數(shù)據(jù)來(lái)源，統(tǒng)計(jì)測(cè)試的各個(gè)環(huán)節(jié)中所使用到的定量設(shè)備以及溫度和時(shí)間等關(guān)鍵因素作為B類(lèi)不確定度的數(shù)據(jù)來(lái)源，最后合成A類(lèi)與B類(lèi)不確定度，從而得出一個(gè)合成擴(kuò)展不確定度作為方法的不確定度U=2×0.058 7=11.7%（k=2）。

3 結(jié)論

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出采用ELISA的方法可以準(zhǔn)確測(cè)定大豆分離蛋白、薯?xiàng)l、淋洗水中麩質(zhì)的含量，其準(zhǔn)確性和精密度均能符合標(biāo)準(zhǔn)要求、不確定度也能比較準(zhǔn)確地體現(xiàn)該方法結(jié)果的可信賴(lài)程度、檢出限也能符合歐盟的法規(guī)要求。表明本文通過(guò)ELISA的測(cè)試方法解決了LC-MS/MS測(cè)試成本高、PCR只能測(cè)基因片段而不是測(cè)試致敏蛋白導(dǎo)致的假陽(yáng)性問(wèn)題以及PCR和側(cè)向流動(dòng)技術(shù)僅為定性法的問(wèn)題，因此采用該方法測(cè)試麩質(zhì)過(guò)敏原是一個(gè)成本較低、定量準(zhǔn)確的較好的選擇，不僅有利于企業(yè)對(duì)自己上市的產(chǎn)品進(jìn)行篩查，還利于監(jiān)管單位對(duì)市售產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管。