汪潔，黃宇翔，蘇麗清，伊雪*，石鶯

（1.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 廈門(mén) 361023；2.廈門(mén)醫(yī)學(xué)院機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén) 361023）

蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining），簡(jiǎn)稱HE染色法，是石蠟切片技術(shù)的常用染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，可使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。將組織切片放入染料后，經(jīng)一定時(shí)間，使組織細(xì)胞或其他成分染上不同的顏色，產(chǎn)生不同的折射率，最后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察和研究。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法之一。

隨著科學(xué)的不斷發(fā)展，微電子技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷進(jìn)步，程序控制的全自動(dòng)式組織切片染色機(jī)應(yīng)運(yùn)而生。染色機(jī)可完成模擬手工操作的方法，可連續(xù)進(jìn)行染色、自動(dòng)記憶，具有可重復(fù)性、穩(wěn)定性，染色效果好、質(zhì)量控制佳等優(yōu)點(diǎn)[1]。同時(shí)，其可取代手工操作中繁雜且對(duì)人體有害的環(huán)節(jié)，顯著降低勞動(dòng)力及時(shí)間成本，提高工作效率，滿足廣大病理技術(shù)工作者的要求，對(duì)病理科及現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)室的推進(jìn)具有重要意義[2]。本校組織病理實(shí)驗(yàn)室于2015年采購(gòu)了Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間對(duì)程序設(shè)置的研究學(xué)習(xí)，體會(huì)如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2019年5月至2020年5月廈門(mén)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院胸心外科及廈門(mén)醫(yī)學(xué)院呼吸疾病研究所送檢的各類活檢組織標(biāo)本400例。

1.2 儀器 Leica ASP20S全自動(dòng)脫水機(jī)、Leica EG1150H+EG1150C組織包埋機(jī)（含冷臺(tái)）、Leica RM2235石蠟切片機(jī)、Leica HI1210攤片機(jī)、Leica HI1220烤片機(jī)、Leica ST5010全自動(dòng)染色機(jī)。

1.3 試劑 改良Lillie-Mayer蘇木精液，1%醇溶伊紅，1%水溶伊紅、1%鹽酸酒精、0.5%鹽酸酒精、4%乙酸、飽和碳酸鋰水溶液、二甲苯及梯度酒精。

1.4 Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)程序設(shè)置 Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)程序的具體設(shè)置，見(jiàn)表1。

表1 Leica ST5020全自動(dòng)染色機(jī)程序設(shè)置

2 結(jié)果

2.1 蘇木精染色前經(jīng)乙酸酸化的結(jié)果分析 切片進(jìn)入蘇木精液前先經(jīng)4%乙酸15 min后，鏡下顯示胞核呈藍(lán)色，核內(nèi)染色質(zhì)顆粒細(xì)膩，核仁、核膜清晰，紅藍(lán)對(duì)比良好，透明度高，見(jiàn)圖1。

圖1 蘇木精染色前經(jīng)乙酸酸化的結(jié)果分析（×400）

2.2 鹽酸酒精分化液不同濃度及處理方式比較如將分化時(shí)間精確為1 s，仍出現(xiàn)分化過(guò)度的情況（圖2A），可將鹽酸酒精的濃度從1%降至0.5%。鏡下見(jiàn)染色核質(zhì)分明，色彩鮮艷（圖2B）。如鹽酸酒精的濃度不變，將分化后的切片重新進(jìn)入改良Lillie-Mayer蘇木精液中染2 min后水洗返藍(lán)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)中吸附過(guò)多的染料，間質(zhì)中也出現(xiàn)不應(yīng)著色的區(qū)域，背景偏灰，透明度不高（圖2C）。

圖2 鹽酸酒精分化液不同濃度及處理方式比較（×200）

3 討論

3.1 HE染色前烤片 一般在65℃的溫箱內(nèi)烤片30～60 min。溫度過(guò)高，會(huì)引起切片細(xì)胞收縮；時(shí)間＜20 min，易造成脫片[3-4]。

3.2 二甲苯脫蠟 脫蠟要徹底，時(shí)間的設(shè)置需根據(jù)環(huán)境中溫度、濕度、切片溫度、二甲苯使用時(shí)間及脫蠟片數(shù)決定，時(shí)間寧長(zhǎng)勿短。脫蠟徹底的切片呈透明狀，若呈云霧狀說(shuō)明脫蠟不徹底[2]。脫蠟不干凈將影響染色，造成切片染色不均的現(xiàn)象。

3.3 梯度酒精脫二甲苯 切片用二甲苯脫蠟后，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，需經(jīng)酒精進(jìn)行溶解，酒精可溶解二甲苯，又能與水混合。組織脫蠟后經(jīng)由高至低的梯度濃度酒精處理后可進(jìn)行水洗并與水溶性的染色劑結(jié)合。

3.4 染色前組織切片酸化 參照陳世梁等[5]研究，將切片進(jìn)入蘇木精染液前先經(jīng)4%乙酸酸化15 min。一方面酸化的組織切片，可增加細(xì)胞核的選擇性染色，使細(xì)胞核染色質(zhì)顯示更加清晰細(xì)致，從而提高染色質(zhì)量。另一方面可穩(wěn)定蘇木精染液的pH值，防止氧化膜形成，延長(zhǎng)染液的使用壽命。鏡下見(jiàn)細(xì)胞核呈藍(lán)色，核內(nèi)染色質(zhì)顆粒細(xì)膩，核仁、核膜清晰，紅藍(lán)對(duì)比良好，透明度高。因此，將該步驟設(shè)置在常規(guī)程序中。

3.5 分化液濃度的選擇及時(shí)間的設(shè)置 HE染色鹽酸酒精分化至關(guān)重要，手工染色分化程序需鏡下控制，一般為1～3 s。由于機(jī)械手起落需耗時(shí)間，不像手工染色時(shí)快速水洗，即使精確設(shè)置為1 s，還會(huì)出現(xiàn)分化過(guò)度的情況。查閱相關(guān)資料[6]，按照兩種方法進(jìn)行設(shè)置，一是將鹽酸酒精的濃度從1%降至0.5%，達(dá)到較好的分化效果。二是鹽酸酒精的濃度不變，將分化后的切片重新浸入Harris蘇木精液中染色2 min后水洗，再浸入飽和碳酸鋰水溶液返藍(lán)，染色對(duì)比度、透明度較降低分化液濃度效果差。染色結(jié)束后，需將鹽酸酒精分化液倒入棕色瓶?jī)?nèi)，以免長(zhǎng)期放在機(jī)器內(nèi)，腐蝕電子元件[2]。

3.6 返藍(lán)液的選擇 返藍(lán)液為弱堿性自來(lái)水或返藍(lán)液。目的是中止鹽酸酒精分化，使在酸性環(huán)境下呈紅褐色的切片多為藍(lán)色。可用自來(lái)水沖洗，也可用0.5%氨水或飽和碳酸鋰水溶液等，均可達(dá)到返藍(lán)的目的。

3.7 伊紅染液 可選醇溶，也可選擇水溶。如選擇1%醇溶伊紅，設(shè)置程序時(shí)醇溶性伊紅使用過(guò)程中，為減少過(guò)多的水分帶入伊紅影響染色效果，可先浸入70%乙醇溶液約1 s，再染伊紅，后入水洗去浮色。而采用水溶性伊紅染色則無(wú)需該步驟。切片在70%乙醇中的時(shí)間要短，因70%乙醇與1%鹽酸酒精中酒精濃度一致，對(duì)切片具有一定分化作用，且低度酒精對(duì)伊紅有分色及褪色作用，因此，時(shí)間一般設(shè)置在數(shù)秒內(nèi)。

3.8 脫水、透明劑的選擇 染色后組織經(jīng)從低到高的濃度酒精處理，去除組織中殘留的水分，為二甲苯透明組織創(chuàng)造條件，使組織切片的透明度達(dá)到光鏡觀察時(shí)的要求。最后一缸無(wú)水乙醇純度要高，防止將水帶入二甲苯；最后一缸二甲苯純度同樣要高，以便將無(wú)水乙醇徹底脫凈。如環(huán)境中濕度高、使用時(shí)間長(zhǎng)、處理的切片多，需及時(shí)更換無(wú)水乙醇跟二甲苯。

3.9 試劑位置的放置 程序設(shè)置時(shí)需將水洗的步驟靠近水槽輸出口，可防止機(jī)械手提起染色架時(shí)染液滴入其他試劑中。分化、返藍(lán)試劑也應(yīng)放置在水槽邊，以縮短機(jī)械手在空中停留的時(shí)間。

3.10 時(shí)間設(shè)置 多個(gè)程序同時(shí)運(yùn)行時(shí)應(yīng)設(shè)置好時(shí)間，避免程序沖突。脫蠟、透明所用的二甲苯和脫二甲苯、脫水的無(wú)水乙醇可采用部分更新的方法，即第一缸試劑倒入廢液桶，后面的試劑前移，最后一缸倒入新液。

自動(dòng)染色機(jī)的程序設(shè)置與多種因素相關(guān)，不同品牌的染色機(jī)程序設(shè)置不同，同一型號(hào)的染色機(jī)程序設(shè)置上也存在差異。為達(dá)到更好的染色效果，需實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員在實(shí)際操作過(guò)程中進(jìn)行不斷探索研究。