何璋海
(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院,廣東 廣州)
蘇木精-伊紅染色法,簡(jiǎn)稱HE 染色,業(yè)界最常用的一種組織學(xué)染色法,E 代表Eosin,伊紅,作用是顯示細(xì)胞漿、肌纖維、膠原纖維、嗜酸性顆粒、紅細(xì)胞等組織呈現(xiàn)不同程度的紅色或粉紅色,與胞核染料蘇木精在色澤上形成鮮明的紅藍(lán)對(duì)比,從而清晰的顯示出組織與細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)[1]。但實(shí)際工作中,使用醇溶性伊紅進(jìn)行染色,胞漿、肌纖維等結(jié)締組織容易出現(xiàn)伊紅過(guò)染或者染色不均的現(xiàn)象,主要是由于其分化程度難以掌握,導(dǎo)致核漿對(duì)比模糊,而且它揮發(fā)性強(qiáng),性價(jià)比不高,不太符合大批量HE 片的制作。針對(duì)存在的問(wèn)題,我們用改良型水溶性伊紅液和醇溶性伊紅液進(jìn)行對(duì)比染色,報(bào)道如下。
德國(guó)Leica 公司的ST5020 全自動(dòng)HE 染色機(jī)。
改良型Harris`蘇木素、0.5%改良型水溶性伊紅液、0.5%醇溶性伊紅液、1%鹽酸酒精、75%酒精、85%酒精、95%酒精、無(wú)水乙醇、苯酚二甲苯混合液[2]、二甲苯。
1.3.1 0.5%改良型水溶性伊紅液
水溶性伊紅粉末 2.5g,將其溶于500mL 蒸餾水,充分溶解,過(guò)濾。臨用前 每440mL 水溶性伊紅液滴加240 微升冰醋酸,充分混勻。
1.3.2 0.5%醇溶性伊紅液
醇溶性伊紅粉末2.5g,溶于500mL95%酒精,充分溶解,過(guò)濾,臨用前每440mL 醇溶性伊紅液滴加4 滴(約40 微升)冰醋酸。
1.3.3 改良型Harris`蘇木素
將蘇木精5g 溶于50mL 無(wú)水乙醇,硫酸鋁鉀100g 溶于1000mL 蒸餾水中,煮沸溶解,然后將兩液均勻混合至染液呈淡紅色,繼續(xù)加熱煮沸后取出,待30s 后緩慢加入氧化汞,待染液呈深紫色立即置入冰水中,待冷卻至室溫后過(guò)濾[3]。臨用前每440mL 蘇木素添加15mL 冰醋酸,充分混勻。
應(yīng)用我科的常規(guī)活檢組織切片分成A、B 兩組,置于70°c烤箱烤片20min,然后分別在全自動(dòng)染色機(jī)上作HE 染色,但是兩種伊紅染液將設(shè)置不同的程序進(jìn)行染色,如下:
A 組:(1)二 甲 苯5min×2;(2)95% 酒 精5min×2;(3)85% 酒 精3min×1;(4)75% 酒 精1min×1;(5)自 來(lái) 水 洗30s×1;(6)改良型Harris` 蘇木素2min×1;(7)自來(lái)水洗5s×1;(8)1%鹽酸酒精3s×1;(9)自來(lái)水洗10min×1;(10)0.5%改良型水溶性伊紅50s×1;(11)自來(lái)水洗6s×1;(12)75% 酒 精3s×1;(13)85% 酒 精3s×1;(14)95% 酒 精5s×1;(15)苯酚二甲苯5min×2;(16)二甲苯2min×3。
B 組:(1)二 甲 苯5min×2;(2)95% 酒 精5min×2;(3)85% 酒 精3min×1;(4)75% 酒 精1min×1;(5)自 來(lái) 水 洗30s×1;(6)改 良 型Harris` 蘇 木 素2min×1;(7)自 來(lái) 水 洗5s×1;(8)1%鹽酸酒精3s×1;(9)自來(lái)水洗10min×1;(10)0.5%醇溶性伊紅50s×1;(11)75%酒精3s×1;(12)85%酒精3s×1;(13)95%酒精5s×1;(14)苯酚二甲苯5min×2;(15)二甲苯2min×3。
程序完成后,取出染片,用中性樹(shù)膠封片。
HE 染色結(jié)果顯示胞漿、肌纖維、膠原纖維及嗜酸性顆粒、紅細(xì)胞等組織呈現(xiàn)不同程度的紅色或粉紅色,顏色鮮艷,與藍(lán)色的細(xì)胞核對(duì)比清晰,層次分明。
HE 染色結(jié)果顯示顏色稍微暗啞,部分染片伊紅著色不均,核漿對(duì)比不太清晰。
圖1 0.5%醇溶性伊紅染色液 腸組織 10X0.25 倍鏡下圖
圖2 0.5%水溶性伊紅染色液 腸組織 40X0.65 倍鏡下圖
兩種伊紅染液的優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比情況
通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)0.5%改良型水溶性伊紅液配制簡(jiǎn)便,不易揮發(fā),著色速度快,染色時(shí)間容易控制,組織染色均勻,顏色鮮艷。而0.5%醇溶性伊紅液配制繁瑣,易揮發(fā),分化節(jié)點(diǎn)難控制,容易造成組織染色不均及顏色暗啞,這是歸因于染片前面經(jīng)過(guò)水洗藍(lán)化,水分或多或少帶到醇溶性伊紅這缸染液,隨著染片量的增多,濃度會(huì)不斷稀釋,加上后續(xù)的75%酒精、85% 酒精都會(huì)對(duì)其起到褪色作用,因此醇溶性伊紅液的分化程度會(huì)比水溶性伊紅難以掌握,還有它的揮發(fā)性強(qiáng),每次染片前都需要補(bǔ)液,經(jīng)濟(jì)性上也比水溶性伊紅要差。對(duì)于制片工作量大的科室來(lái)說(shuō),尋找一種高效穩(wěn)定、性價(jià)比高的伊紅染液實(shí)屬必要,而我們對(duì)傳統(tǒng)型的水溶性伊紅作出改良配制,同樣可以制作出核漿對(duì)比清晰、紅藍(lán)色彩艷麗、層次分明的優(yōu)質(zhì)HE 片,縱觀伊紅液的染色原理得知其屬于酸性染料,在水中電離成帶負(fù)電荷的陰離子,與蛋白質(zhì)的氨基正電荷結(jié)合而使胞質(zhì)染色,所以合理利用冰醋酸來(lái)調(diào)節(jié)伊紅液的PH 值更是胞漿染色是否艷麗的關(guān)鍵步驟,量不足,伊紅僅通過(guò)滲透或彌散作用,伊紅很難著色,而且與組織結(jié)合不牢固,分化后容易褪色;過(guò)量,則使染色體也發(fā)生電離導(dǎo)致其帶正電,造成核漿對(duì)比不清,另一方面也會(huì)抑制伊紅電離導(dǎo)致沉淀,染色失效[4]。
總之,控制好添加冰醋酸的量,改善染色程序,同樣可以使廉價(jià)、配制簡(jiǎn)單的水溶性伊紅做到高效地解決染色不均、核漿對(duì)比不清晰等問(wèn)題,另外,隨著浸染式染色平臺(tái)在各家醫(yī)院病理科的推廣使用,因其成本相對(duì)低以及試劑開(kāi)放等特點(diǎn)[5],在保證醫(yī)療質(zhì)量的同時(shí)還能提高效益性,特別適用于大批量機(jī)染的制作單位。