李金龍，馬葉艷，張旭東，宋 欣,馬亞琪

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心病理科，北京 10086；2.長治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，山西長治 046000）

活檢小標(biāo)本的包埋制作是病理技術(shù)工作中的一大難題。由于取材的局限性，取材組織數(shù)量少、體積小給技術(shù)員在制片過程中帶來了一定的困難[1]。雖然目前國內(nèi)外對(duì)于小標(biāo)本的預(yù)處理方法不盡相同，但大多都是采用不同酸類溶液酸化的伊紅溶液進(jìn)行脫水前或（和）脫水中滴染的方法進(jìn)行標(biāo)本的預(yù)染色，然而由于試劑的易得程度、配置方法、滴加劑量等方面都沒有一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的方案，大多數(shù)單位的小標(biāo)本的預(yù)處理效果并不令人滿意，由此給后續(xù)的常規(guī)及免疫組化（或分子病理）等過程造成了較大的影響，在此，筆者通過對(duì)三組常規(guī)小標(biāo)本分別滴加水溶性伊紅溶液、醋酸化伊紅溶液和鹽酸化的伊紅溶液進(jìn)行預(yù)染色的方法，對(duì)比脫水后三組蠟塊的肉眼顏色區(qū)別及制片后的鏡下顏色區(qū)別，對(duì)比分析不同酸類酸化的伊紅溶液對(duì)小標(biāo)本預(yù)染色的效果。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 從解放軍總醫(yī)院病理科的日常病理標(biāo)本中隨機(jī)選取組織直徑均小于0.5cm的胃腸鏡活檢組織和穿刺組織標(biāo)本共計(jì)90例，均分為3組，每組30例，均由中性福爾馬林溶液固定。本實(shí)驗(yàn)選用的組織標(biāo)本必須符合以下標(biāo)準(zhǔn)：（1）正常臨床活檢的標(biāo)本；（2）組織標(biāo)本均采用中性福爾馬林溶液固定，符合臨床試驗(yàn)的相關(guān)要求。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑 ：0.810g/cm3的乙醇溶液，伊紅染液，鹽酸酒精溶液，氨水溶液，鹽酸溶液，冰醋酸溶液等均由實(shí)驗(yàn)室按照標(biāo)準(zhǔn)操作配置，水溶性伊紅 Y 粉劑、中性福爾馬林溶液、無水乙醇等其他試劑均購自國藥，分析純。

1.2.2 儀器設(shè)備：全自動(dòng)組織脫水機(jī) LEICA ASP200S，包埋機(jī)，冷凍臺(tái)，切片機(jī)，水浴展片機(jī)，烤片機(jī)，羅氏VENTANA HE 600全自動(dòng)染色系統(tǒng)，顯微鏡等。

1.2.3 不同伊紅溶液試劑配制[2-4]：①水溶性伊紅溶液：將1 g伊紅Y粉劑溶于少許蒸餾水中，用玻璃棒攪拌溶解后，加蒸餾水至100 ml。②冰醋酸化伊紅溶液：將1 g伊紅Y粉劑溶于少許蒸餾水中,用玻璃棒攪拌溶解后,加蒸餾水至100 ml,充分?jǐn)嚢韬蠹颖姿嶂羛H值5～6之間。③鹽酸化伊紅溶液：伊紅Y用蒸餾水充分溶解加濃鹽酸10 ml，攪拌均勻，放置過夜，析出沉淀，用濾紙過濾，濾液不要，沉淀物與濾紙一起放恒溫箱干燥，用0.810g/cm3的乙醇1 000 ml配成沉淀酸化伊紅Y乙醇儲(chǔ)存液，臨用時(shí)，取飽和液1份，加0.810g/cm3的乙醇2份，配成工作液，待用。

1.3 方法

1.3.1 組織脫水：將固定好的活檢組織小標(biāo)本由醫(yī)生取材完畢后，分成三組，每組均為30例，共計(jì)90例，分別滴加冰醋酸化伊紅溶液、鹽酸化伊紅溶液及對(duì)照水溶性伊紅溶液，然后放入同一脫水機(jī)進(jìn)行脫水。

1.3.2 組織包埋、修塊

1.3.3 切片、撈片與烤片

1.3.4 組織常規(guī)HE染色：染色均使用羅氏VENTANA HE600全自動(dòng)滴染氏染色機(jī)進(jìn)行染色，排除染色染液污染和染色力等影響因素，染色效果均一穩(wěn)定，染色玻片間無交叉污染[5]。

1.3.5 鏡下觀察及肉眼觀察：將染好的切片置于鏡下觀察、對(duì)比；將制成的蠟塊進(jìn)行肉眼觀察并按判定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。

1.3.6 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) ：根據(jù)蠟塊組織判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)判，判定標(biāo)準(zhǔn)[6]：組織呈鮮紅色判定為（++），組織呈淡紅色判定為（+），無伊紅著色判定為（-）；

鏡下評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《臨床技術(shù)操作規(guī)范-病理學(xué)分冊(cè)》中對(duì)于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色以及交叉污染的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用秩和檢驗(yàn)分析。P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組蠟塊著色比較 脫水后進(jìn)行組織包埋觀察：水溶性伊紅溶液滴染組組織著色較淡，不易識(shí)別，包埋后組織與石蠟對(duì)比不明顯，冰醋酸化伊紅溶液組和鹽酸化伊紅溶液組滴染組織著色均較深，易識(shí)別，包埋后組織與石蠟對(duì)比明顯。鹽酸化伊紅溶液組呈鮮紅色的共28例，淡紅色的2例；醋酸化伊紅溶液組呈鮮紅色的共27例，淡紅色的3例；水溶性伊紅溶液組呈鮮紅色的共20例，淡紅色的6例，無伊紅著色4例；經(jīng)脫水包埋后，肉眼觀察蠟塊著色情況按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判，分析數(shù)據(jù)后可得：鹽酸化伊紅溶液組著色鮮明且沒有脫色，與水溶性伊紅溶液組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.923，P=0.009）；醋酸化伊紅溶液組著色鮮明且沒有脫色，與水溶性組比較伊紅溶液有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.221，P=0.022）；鹽酸化伊紅溶液組和醋酸化伊紅溶液組均著色鮮明沒有脫色，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.215，P=0.643）。常規(guī)組織染色后，鏡下觀察三種溶液滴染的組織切片，發(fā)現(xiàn)其組織結(jié)構(gòu)均清晰，顏色對(duì)比分明，三者之間無明顯區(qū)別(圖1～3)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：鹽酸化伊紅溶液組與醋酸化伊紅溶液組相比，蠟塊著色無明顯差異(P＞0.05)，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余每兩組間蠟塊著色差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可認(rèn)為兩種酸化方法對(duì)活檢小標(biāo)本的預(yù)染色無顯著差異，水溶性伊紅溶液與兩種酸化伊紅溶液對(duì)活檢小標(biāo)本的預(yù)染色有顯著差異。

圖1 醋酸化伊紅溶液組胃竇，HE 低倍

圖2 鹽酸化伊紅溶液組胃體，HE 低倍

圖3 水溶性伊紅溶液組右肺穿刺組織，HE 低倍

2.2 三種伊紅染色液使用效果比較 見表1。三種伊紅染液使用效果比較，水溶性伊紅溶液著色效果不穩(wěn)定，容易出現(xiàn)脫色現(xiàn)象，該溶液配制簡便，用時(shí)短且無額外成本；鹽酸化伊紅溶液著色效果穩(wěn)定，偶有脫色，該溶液配制過程繁瑣，用時(shí)較長且成本偏高；醋酸化伊紅溶液著色效果穩(wěn)定，偶有脫色，該溶液配制方法簡便，用時(shí)較短且成本不高。

表1 不同酸類酸化的伊紅溶液使用效果對(duì)比

3 討論

本院內(nèi)鏡活檢及穿刺活檢組織工作量較大，在固定液中加入伊紅，會(huì)增加工作量并造成試劑的浪費(fèi)，所以本科室采用取材時(shí)對(duì)組織滴染水溶性伊紅染液的方法及在脫水機(jī)程序的第一缸酒精中滴加伊紅的方法來處理該問題。然而在本科室的實(shí)際使用情況中發(fā)現(xiàn)，在脫水機(jī)程序的第一缸酒精中滴加伊紅的方法雖然能使包埋濾紙充分著色，但是同樣也會(huì)造成由于組織與包埋濾紙均著色而導(dǎo)致兩者不易區(qū)分，進(jìn)而影響包埋效果的情況出現(xiàn)，更容易造成組織漏包少包的現(xiàn)象。取材時(shí)對(duì)組織滴染伊紅染液也存在滴入量缺乏有效量化的問題,只能根據(jù)個(gè)人經(jīng)驗(yàn)滴加，容易造成染色效果的不穩(wěn)定性[6]，實(shí)際運(yùn)用過程中也往往出現(xiàn)包埋時(shí)組織著色不均的情況。

經(jīng)查閱文獻(xiàn)，pH值對(duì)于染色至關(guān)重要，殘留在污漬中的水或試劑即可改變pH值并改變?nèi)旧禺愋訹7]。伊紅溶液是酸性染液，在水中離解成帶負(fù)電荷的陰離子，與蛋白質(zhì)的氨基正電荷（陽離子）結(jié)合而使細(xì)胞質(zhì)染色，加入冰醋酸后，可以影響組織中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，從而影響蛋白質(zhì)的電離，促進(jìn)組織與染料以離子鍵牢固結(jié)合。伊紅溶液中加入冰醋酸，起到促染作用，只增強(qiáng)染料的染色能力，不參與染色反應(yīng)。所以在伊紅染液里滴加冰醋酸使伊紅溶液的pH值調(diào)節(jié)是胞質(zhì)染色的關(guān)鍵[8]。酸化伊紅可以促使細(xì)胞質(zhì)著色，在配制染液中，我們加入適量的酸，其目的是為了增強(qiáng)組織細(xì)胞的染色力[9]。因此，筆者根據(jù)文獻(xiàn)配置不同酸類酸化的伊紅溶液后滴染活檢小標(biāo)本，并制作組織切片觀察染色效果。效果顯示，酸化的伊紅確實(shí)比水溶性伊紅著色力強(qiáng)，且不易脫色，也不參與后期試劑反應(yīng)；但從經(jīng)濟(jì)角度、配制方法及使用時(shí)間來看，冰醋酸化法較鹽酸化法染色液的配制更簡便易得，也更實(shí)惠。

綜上所述，小標(biāo)本取材時(shí)采用冰醋酸化的伊紅溶液滴染組織，著色效果好，配制簡單，可提高病理標(biāo)本制作的工作效率，值得推廣。