田玉旺 朱紅艷 朱培雙 邢 宜

（北京軍區(qū)總醫(yī)院病理科，北京100700）

在常規(guī)HE染色過程中，要求切片核漿對比要分明，細(xì)胞漿染色質(zhì)量的好壞亦至關(guān)重要。伊紅是細(xì)胞漿常用的染色劑，其配制方法較多，多用水溶性伊紅染色液，在染色過程中發(fā)現(xiàn)水溶性伊紅染色液易出現(xiàn)著色過淡、核漿共染及染色后的切片置一段時間后易褪色等現(xiàn)象，給觀察切片的組織形態(tài)帶來一定困難。我們根據(jù)伊紅的化學(xué)性質(zhì)和染色理論，結(jié)合實際應(yīng)用情況，對傳統(tǒng)伊紅染液的配制方法進(jìn)行了一些改良，收到了理想的染色效果。

材料和方法

1.標(biāo)本

選取我院臨床送檢的活檢組織，包括食管、闌尾和子宮肌瘤各20例，均采用10%中性福爾馬林固定，常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟和包埋。所有組織統(tǒng)一切片，每塊組織各切片2張，分成兩組，一組用水溶性伊紅染液進(jìn)行染色，另一組采用改良的伊紅染液進(jìn)行染色。

2.傳統(tǒng)水溶性伊紅染液的配制方法

1g伊紅Y，蒸餾水200ml，充分混溶后加冰醋酸1滴。

3.改良的伊紅染色液配制方法

1%熒光桃紅B水溶液10ml，1%伊紅Y水溶液100ml，780ml 95%乙醇，4ml冰醋酸，充分混合溶解后即可使用。

4.染色方法

兩組切片同時用二甲苯脫蠟至自來水，蘇木素染色6min，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘，自來水洗，0.5%氨水返藍(lán)20s，水洗后入伊紅染液。第一組入水溶性伊紅染液染色1min，第二組入改良的伊紅染液染色1min，兩組同時水稍洗后入80%乙醇1－2s，95%乙醇、無水乙醇I、II各1－2min，二甲苯I、II透明各3－5min，中性樹膠封固。

結(jié) 果

傳統(tǒng)水溶性伊紅染液染色：細(xì)胞漿、肌纖維、膠原纖維等染色不夠鮮艷，紅色偏淡（圖1），切片染色后很容易褪色，且染液使用時間較短。

改良的伊紅染色液染色：伊紅著色能力強(qiáng)，色澤鮮艷，細(xì)胞漿和其他組織成分呈現(xiàn)出深淺不一的紅色，肌纖維呈鮮紅色，膠原纖維呈粉紅色（圖2）。

圖1 食管組織：伊紅染色淡。水溶性伊紅染色×100圖2 食管組織：伊紅染色鮮艷。改良的伊紅染色×100Fig.1 Esophageal tissue：Eosin staining light.Water soluble eosin stain×100Fig.2 Esophageal tissue：Eosin staining bright red.Modified eosin stain×100

討 論

伊紅Y的化學(xué)名稱為四溴熒光素二鈉鹽，含有一個醌型苯環(huán)的發(fā)色基和兩個形成鈉鹽的酸性助色基。其溶于水中就能離解成帶負(fù)電荷的色酸部分（即染料的有色部分）和帶正電荷的鈉離子部分（即染料的無色部分）。伊紅染液為弱酸性，組織細(xì)胞的化學(xué)成分從染液中獲得氫離子而成為帶正電荷的離子，繼而與帶負(fù)電荷的陰離子色酸部分相結(jié)合達(dá)到染色效果［1］。伊紅在顯示細(xì)胞漿、嗜酸性顆粒、肌纖維和膠原纖維等時，具有很強(qiáng)的親和力，呈現(xiàn)出不同色調(diào)的紅色，它是最適合與蘇木素相結(jié)合用以顯示組織結(jié)構(gòu)的染料。

在常規(guī)HE染色過程中，多用水溶性配制的伊紅Y染色液對組織進(jìn)行染色，我們在實際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)，這些水溶性伊紅染色液配制方法簡便，但普遍存在對細(xì)胞質(zhì)的著色力較弱，特別是對肌纖維、膠原纖維、細(xì)胞漿等染色不夠鮮艷，顏色偏淡。在水洗、分化和脫水過程中較易褪色，染液的使用有效期較短，應(yīng)用一段時間后染液有沉淀產(chǎn)生，染色效果明顯下降，核漿對比不明顯。

近年來，許多單位使用沉淀的酸化伊紅染液，該配方中加入了醋酸或鹽酸，其目的是造成染液比細(xì)胞質(zhì)等電點（PI＝4.7－5.0）更為酸性的環(huán)境，細(xì)胞質(zhì)發(fā)生堿式電離，帶正電，因而與帶負(fù)電荷的陰離子色酸部分相結(jié)合而達(dá)到染色效果。但我們發(fā)現(xiàn)該染液p H值低于細(xì)胞核染色質(zhì)等電點（PI＝3.3），使細(xì)胞核染色質(zhì)也發(fā)生堿式電離，帶有正電而被酸性染料染成紅色，從而導(dǎo)致出現(xiàn)核漿共染現(xiàn)象。另外由于伊紅染液的酸性增強(qiáng)，致使其著色速度增快，染色時不易控制，易出現(xiàn)細(xì)胞漿著色過深現(xiàn)象，同時對已染上的蘇木素有褪色作用，導(dǎo)致組織切片核漿對比不鮮明。

本文經(jīng)大量實驗，對傳統(tǒng)的伊紅染液配方進(jìn)行了改良，即在伊紅Y染液中加入適量的熒光桃紅B染液，組成伊紅Y和熒光桃紅B混合染色液，這樣可以更明確地顯示不同的組織成分，肌組織和膠原纖維將很容易區(qū)別，紅細(xì)胞的顏色會更加明亮。熒光桃紅B又稱焰紅B，為一種磚紅色粉末［2］，伊紅Y溶液中加入適量熒光桃紅B溶液后，能使細(xì)胞質(zhì)的色澤更為鮮艷，對肌纖維和膠原纖維具有很強(qiáng)的親和力，增強(qiáng)了與細(xì)胞核的對比度。應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)改良的伊紅染色液，染色力明顯增強(qiáng)，使色澤更加鮮艷，染色穩(wěn)定，紅藍(lán)相映，核漿對比明顯，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞漿和其他組織成分呈現(xiàn)出深淺不一的紅色，尤其對肌纖維、纖維結(jié)締組織和胞漿內(nèi)嗜酸性顆粒著色鮮艷，相比之下單純性水溶性伊紅液細(xì)胞質(zhì)著色較慢，顏色也偏淡。

在配制伊紅染液中，我們均加入適量的冰醋酸，其目的是為了增強(qiáng)組織細(xì)胞的染色力。伊紅是一種酸性紅色細(xì)胞漿染料，由于鈉離子的存在而呈堿性狀態(tài)，冰醋酸與鈉離子結(jié)合后使溶液呈酸性帶負(fù)電，而易與帶正電的細(xì)胞漿結(jié)合。細(xì)胞漿的等電點為p H4.7－5.0，在伊紅染液中加入冰醋酸就是把p H值調(diào)到細(xì)胞漿等電點p H4.7以下使細(xì)胞漿發(fā)生堿式電離帶正電，易與帶負(fù)電的酸性染料伊紅結(jié)合在一起。但我們必須嚴(yán)格控制好加入冰醋酸的量，不加或加入少量冰醋酸，伊紅只能通過滲透或彌散作用很難染色，而且和組織結(jié)合也不牢固，分化后易褪色；加入過量冰醋酸，使p H值變得太低，使染色體等電點到p H＝3.3以下，一方面使染色體也發(fā)生堿式電離帶正電也被酸性染料染色，造成核、質(zhì)對比不清；另一方面抑制了伊紅電離，形成水溶性伊紅Y沉淀，導(dǎo)致染色液失效；另外易引起色調(diào)不正，切片特別容易褪色，染色結(jié)果不能長期保存。因此染液的p H應(yīng)調(diào)到小于細(xì)胞漿等電點，而大于細(xì)胞核等電點時，染片效果最好。

伊紅染色應(yīng)以蘇木素對細(xì)胞核染色程度為標(biāo)準(zhǔn)，以求達(dá)到對比鮮艷清晰，層次清楚。伊紅染色時間與染液的新舊，所染組織切片的厚薄，組織的新鮮與陳舊以及經(jīng)乙醇分化調(diào)色和乙醇濃度有關(guān)。在染液使用過程中，可采用肉眼觀察來控制切片著色深淺，顯微鏡下觀察切片染色效果，及時了解染液使用情況。細(xì)胞核過淡而細(xì)胞漿過濃或細(xì)胞漿過淡而細(xì)胞核過濃均影響對組織切片的觀察。伊紅染色程度應(yīng)以對比色彩相適應(yīng)為佳。

［1］龔志錦，詹镕洲.病理組織制片盒染色技術(shù).上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1994，50－51

［2］王伯沄，李玉松，黃高昇等。病理學(xué)技術(shù).北京：人民衛(wèi)生出版社，2000，1066－1067