史玉潔，李芳，王昕

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100）

基因編輯技術(shù)是對靶基因進(jìn)行特異編輯，如突變、敲除或基因的定點(diǎn)整合等，最終達(dá)到改變或修飾基因功能的目的，進(jìn)而影響細(xì)胞、器官甚至個(gè)體生理性狀的一種基因工程技術(shù)?；蚓庉嫾夹g(shù)操作簡單且通用性強(qiáng)，主要經(jīng)歷了鋅指核酸酶 （Zinc-Finger Nucleases，ZFN） 技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription Activator-Like Effector Nucleases，TALEN）技術(shù)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeat，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（Cas）技術(shù)等幾代的發(fā)展歷程，它們的出現(xiàn)使得對任意物種和細(xì)胞基因的精準(zhǔn)編輯成為可能。其中CRISPR 技術(shù)的操作方式和編輯效率明顯優(yōu)于其他早些傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，一經(jīng)出現(xiàn)便被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，尤其在動(dòng)植物基因編輯以及改良動(dòng)物生產(chǎn)性能方面得到成功應(yīng)用。

羊作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物之一，提供奶、毛、絨、肉、皮等多種動(dòng)物產(chǎn)品，同時(shí)也是重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。利用基因編輯技術(shù)提高羊的絨、毛、肉產(chǎn)量、“人源化”羊乳以及作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白等具有重要意義。本文概述了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的發(fā)展歷程、組成及分類、作用方式和原理，總結(jié)了CRISPR/Cas 系統(tǒng)近年來在提升山羊和綿羊生產(chǎn)性能方面的應(yīng)用，并對該技術(shù)的發(fā)展前景作了簡要闡述，為我國畜禽種業(yè)的快速、健康和持續(xù)發(fā)展提供參考。

1 CRISPR 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與分類

CRISPR 系統(tǒng)是原核生物的一種抵抗外源基因入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，也是繼ZFN 和TALEN 后第三代被廣泛應(yīng)用于基因組精準(zhǔn)編輯的人工核酸酶技術(shù)。

1.1 CRISPR 系統(tǒng)的研究歷史 1987 年，日本學(xué)家Ishino等首次在大腸桿菌的基因中發(fā)現(xiàn)特殊的串聯(lián)間隔重復(fù)序列。之后對原核生物的基因組進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這種重復(fù)序列存在于50% 的細(xì)菌和95% 的古細(xì)菌中。直至2002 年，該基因家族被正式命名為CRISPR，并提出用Cas 來命名相關(guān)核酸酶。2008 年，Marraffini 等研究發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的Cas 蛋白主要作用于DNA 序列，CRISPR 可以破壞轉(zhuǎn)染的外源質(zhì)粒。2010 年，Garneau 等研究發(fā)現(xiàn)Cas9 是Cas 蛋白中獨(dú)特的基因簇，可以由酶介導(dǎo)對目標(biāo)DNA 進(jìn)行精準(zhǔn)切割。2013年，Le 等優(yōu)化了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，建立了一個(gè)由CRISPR，tracrRNA 和Cas9 組成的基因調(diào)控系統(tǒng)，并和Mali 等首次利用CRISPR/Cas 系統(tǒng)介導(dǎo)小鼠和人類的細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，成功定點(diǎn)修飾了哺乳動(dòng)物基因組。這對CRISPR 系統(tǒng)來說具有里程碑式意義，為該技術(shù)在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。此后，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)逐漸成為國內(nèi)外研究人員青睞的工具，在生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的相關(guān)研究迅速增加。

1.2 CRISPR 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與類型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)是細(xì)菌為抵抗噬菌體而形成的一種免疫機(jī)制，它可以特異識別入侵的病毒序列并對外源入侵DNA 進(jìn)行切割和降解。CRISPR 是一種特殊的DNA 重復(fù)序列，主要包括前導(dǎo)序列、CRISPR 序列和Cas 相關(guān)蛋白（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9 位點(diǎn)特征[12]

CRISPR 序列由重復(fù)序列（Repeats）和間隔序列（Spacer）相互交替排列組成，重復(fù)序列-間隔序列的單元個(gè)數(shù)多變，在不同物種甚至同一物種中都可能不同。重復(fù)序列高度保守，間隔區(qū)間的回文序列可以形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。間隔序列是被細(xì)菌俘獲的外源DNA 序列，主要來自質(zhì)粒和病毒。相鄰的地方有一段保守序列，被稱作原間隔序列臨近基序（Protospacer Adjacent Motif，PAM），該序列一般由NGG 3個(gè)堿基組成（N代表任意堿基），在CRISPR/Cas 系統(tǒng)中起到識別外源DNA 的重要作用。

Cas 基因家族的種類繁多，編碼的蛋白質(zhì)具有與核苷酸結(jié)合的功能以及與核酸酶、聚合酶、解旋酶等多種酶類結(jié)合的活性，其編碼的蛋白都可以與CRISPR序列區(qū)域共同發(fā)生作用。

根據(jù)CRISPR RNA（crRNA）成熟的方式及Cas蛋白的種類和功能的差異，可將CRISPR 系統(tǒng)分為兩大類，進(jìn)而分為6 種亞型（圖2）。第一類為多種效應(yīng)蛋白復(fù)合物組成的干擾靶基因的系統(tǒng)，包含I、III 和IV 型；第二類為單一效應(yīng)蛋白組成的干擾靶基因的系統(tǒng)，包括II、V 和VI 型。II 型是最為典型、研究最為廣泛的含有Cas9 基因的系統(tǒng)類型。其中Cas9 蛋白具有核酸酶活性，并且在基因附近有一段幫助crRNAs 成熟的反式激活RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）。Cas9 與crRNA 和tracrRNA 結(jié)合，通過構(gòu)象的變化暴露其核酸酶結(jié)構(gòu)域，結(jié)合并切割靶序列，因此產(chǎn)生的雙鏈斷裂通常由同源導(dǎo)向修復(fù)（HDR）和非同源末端連接（NHEJ）進(jìn)行修復(fù)。此外還有V 型CRISPR/Cas12a（Cpf1）和VI 型靶向RNA 的CRISPR/Cas13等其他種類的Cas 蛋白也逐漸被發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步豐富了CRISPR/Cas 系統(tǒng)。

圖2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)分類[24-25]

2 CRISPR/Cas9 技術(shù)在羊育種研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，在基因治療、制作抗體藥物、構(gòu)建模式動(dòng)物等方面得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)在提升羊的生產(chǎn)性能方面也展開了大量研究，為羊的精準(zhǔn)育種提供基礎(chǔ)。

2.1 CRISPR/Cas9 技術(shù)在提升羊肉品質(zhì)研究中的應(yīng)用已有研究表明肌肉生長抑制素（Myostatin，）是一類能夠?qū)趋兰〉纳L起負(fù)調(diào)控作用的基因，抑制哺乳動(dòng)物中的基因可有效促進(jìn)骨骼肌的生長分化，引起雙肌表型。

2014 年，有研究將CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應(yīng)用于編輯和共4個(gè)羊成纖維細(xì)胞基因，并利用體細(xì)胞核移植（Somatic Cell Nuclear Transp lantation，SCNT）方法成功產(chǎn)生了3 只基因敲除山 羊。2015 年，Crispo 等利 用CRISPR/Cas9 技術(shù)和受精卵顯微注射技術(shù)高效生產(chǎn)了基因敲除綿羊，新生22 只羔羊中有10 只羊的基因突變，并表現(xiàn)出雙肌表型和體重顯著增加的現(xiàn)象。這些研究為進(jìn)一步在小反芻動(dòng)物上應(yīng)用CRISPR/Cas9 技術(shù)提供了有效參考。2016 年，Wang 等通過注射單個(gè)sgRNA 至單個(gè)細(xì)胞階段的羊胚胎中，精確靶向敲除了、-（）和（）基因，且未檢測到脫靶效應(yīng)，證明了CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因組編輯的多重性，以及改善綿羊不同基因決定不同性狀的可能性。直至2019 年，Zhang 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)研究了乙酰CoA ?；D(zhuǎn)移酶2（ACCAA2）在綿羊前體脂肪細(xì)胞分化過程中的重要作用，為闡述羊肉品質(zhì)的形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。2020 年，Ding 等利用CRISPR/Cas9 技術(shù)精確刪除了灘羊的基因的長基因組片段，得到的MSTN 敲除羊體重較野生型羊顯著增加，這為接下來動(dòng)物模型的構(gòu)建和基因大片段的刪除或插入的功能研究提供了重要參考。同時(shí)，他們還發(fā)現(xiàn)了雙sgRNA 定向CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以高效敲除哺乳動(dòng)物基因組。

2.2 CRISPR/Cas9 技術(shù)在改良羊毛品質(zhì)研究中的應(yīng)用羊毛纖維長度和平均纖維直徑是綿羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，它與羊毛的產(chǎn)量和質(zhì)量密切相關(guān)。

成纖維細(xì)胞生長因子FGFs 家族成員基因被證明在毛發(fā)生長過程中對毛發(fā)生長期有抑制作用，突變基因可以促進(jìn)毛發(fā)生長并延長毛囊的生長期，進(jìn)而改善羊毛品質(zhì)。Wang 等利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將和基因的Cas9 mRNA 和sgRNA顯微注射至山羊胚胎中，成功獲得和FGF5 雙基因修飾的山羊，所得羊只的羊絨產(chǎn)量和生長速度均顯著提高。Li 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯中國美利奴細(xì)毛羊的基因，獲得了16 只目標(biāo)位點(diǎn)突變的細(xì)毛羊，12 只1 歲基因編輯羊的毛叢自然長度和拉伸長度均顯著長于野生型對照。Zhang 等通過CRISPR/Cas9 干擾基因的表達(dá)，出生的6 只美利奴羔羊中有5 只羊的基因位點(diǎn)缺失，羔羊表現(xiàn)出多種毛色圖案，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，修飾發(fā)生在1個(gè)或2個(gè)以上的基因拷貝中，在靶向修飾位點(diǎn)前第2 外顯子的9 bp 和5 bp 缺失的額外自發(fā)突變可能涉及被毛顏色的形成。Hao 等設(shè)計(jì)了2個(gè)相反的sgRNA 在絨山羊中成功定位了外膜異常酶受體（）基因，并與編碼Cas9 的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染羊成纖維細(xì)胞，測序結(jié)果顯示變異率達(dá)69.7%。胸腺素4（T4）是一個(gè)小分子蛋白，包含43個(gè)氨基酸殘基，可用于激活毛囊干細(xì)胞的遷移和分化。Li 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)并結(jié)合SCNT技術(shù)，以肌源性衛(wèi)星細(xì)胞作為核供體獲得了絨山羊基因在CCR5（趨化因子受體5）上的作用軌跡，敲入T4 基因的山羊產(chǎn)絨量增加74.5%。

2.3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在改造羊乳研究中的應(yīng)用 羊乳與人乳成分接近，是重要的牛乳補(bǔ)充替代品，尤其適合對牛乳過敏體質(zhì)的人群，但羊乳含有-乳球蛋白（-lactoglobulin，BLG）等致敏原，能引起人體過敏反應(yīng)，因此在保證羊乳營養(yǎng)成分的同時(shí)去除其中的致敏成分成為提升羊乳品質(zhì)的重要研究內(nèi)容。

Zhou 等成功利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)生產(chǎn)了基因敲除的山羊，在靶向敲除基因的山羊乳腺組織中發(fā)現(xiàn)BLG 表達(dá)量顯著降低，相關(guān)乳蛋白編碼基因也顯著降低，羊奶中BLG 蛋白也不表達(dá)。周文君等首次使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在山羊的基因位點(diǎn)定點(diǎn)敲入人乳鐵蛋白（hLF）的cDNA 序列，在保證羊乳營養(yǎng)價(jià)值的同時(shí)又減少了羊乳的過敏原性，還發(fā)現(xiàn)10 μmol/L 的RAD51 蛋白激活劑（RS-1）可以顯著提升Cas9 引導(dǎo)的敲入效率。此外，Teng 等利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)結(jié)合顯微注射技術(shù)成功開發(fā)了一種可以生產(chǎn)富含褪黑素羊奶的綿羊生物反應(yīng)器，這些基因編輯羊可能成為褪黑激素的良好來源。Huang 等成功使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)獲得miR-145 敲除的山羊乳腺上皮細(xì)胞，miR-145 敲除降低了TAG（Total Cellular Triacylglycerol）和膽固醇含量，并通過降低與脂肪酸合成相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)而影響脂肪酸組成。

3 CRISPR/Cas9 技術(shù)在其他動(dòng)物育種研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas 系統(tǒng)已經(jīng)成功在豬上實(shí)現(xiàn)了多基因編輯、相關(guān)性狀的遺傳改良等，主要是作為模式動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)研究并為人類疾病的研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。Wang 等利用CRISPR/Cas9 和SCNT 有機(jī)結(jié)合獲得了SIX1-/-和SIX1-/-/SIX4-/-的豬胚胎，其中SIX1-/-/SIX4-/-型豬胚胎表現(xiàn)嚴(yán)重的腎臟發(fā)育遲緩。Xie 等利用CRISPR/Cas9 介導(dǎo)敲入靶向pRSAD2 基因質(zhì)粒，成功獲得豬的pRSAD2-KI 細(xì)胞；體外病毒激發(fā)試驗(yàn)顯示，pRSAD2-KI 細(xì)胞能夠有效地降低豬瘟病毒和偽狂犬病病毒的感染；此外還利用SCNT 技術(shù)成功生產(chǎn)了1只pRSAD2-KI 豬。

牛的基因編輯技術(shù)較其他物種發(fā)展較晚，迄今已開始在基礎(chǔ)疾病相關(guān)基因功能研究、改善遺傳特性、提升肉品質(zhì)及生產(chǎn)藥物蛋白等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Zhou 等利用截短的CRISPR/Cas9 gRNAs（1、2、3和5 bp）對牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)截短3 bp 的gRNA 的CRISPR/Cas9-17 質(zhì)粒能有效降低脫靶效率且不降低?；虼虬行剩S富了CRISPR/Cas9 技術(shù)的編輯策略。Jeong 等利用CRISPR/Cas9 和SCNT 技術(shù)結(jié)合將基因?qū)肱３衫w維細(xì)胞-基因的內(nèi)含子并獲得了轉(zhuǎn)（Human Fibroblast Growth Factor 2）基因的囊胚，在細(xì)胞水平及胚胎水平成功檢測到了基因的表達(dá)。

禽類由于受精卵結(jié)構(gòu)特殊，無法像哺乳動(dòng)物那樣直接通過核移植獲得基因編輯個(gè)體，所以基因編輯技術(shù)在禽類上發(fā)展較為緩慢。Lee 等使用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)和雜交技術(shù)成功獲得了Z 染色體敲除雞，Z染色體編輯的雞可以在胚胎發(fā)育過程中通過檢測熒光進(jìn)行性別鑒定。

4 存在問題及發(fā)展前景

CRISPR/Cas9 作為當(dāng)下最有效、最便捷的基因組編輯技術(shù)，已被應(yīng)用于不同細(xì)胞及物種基因組的高精度改造和修飾，在建立動(dòng)物模型和生物醫(yī)學(xué)等方面有巨大潛力。但目前CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)和PAM 序列的局限性仍然是主要缺陷，所以未來的主要發(fā)展方向仍然是降低脫靶效率，提升其特異性、精準(zhǔn)性和穩(wěn)定性。

此前有研究發(fā)現(xiàn)，縮短sgRNA 互補(bǔ)區(qū)域長度和增加PAM 序列的長度均可以在保證目標(biāo)基因組的編輯效率下顯著降低脫靶率。此外，Kim 等發(fā)現(xiàn)給sgRNA5' 端添加2個(gè)鳥嘌呤也可顯著增加其識別特異性并降低脫靶率。還有研究將腺相關(guān)病毒(Adeno-Associated Virus，AAV) 應(yīng)用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可顯著促進(jìn)其靶向能力并提高編輯效率。Timin 等研究報(bào)道了由可降解聚合物微粒并經(jīng)硅殼修飾的微載體可用于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的傳遞，其轉(zhuǎn)染效率還明顯高于脂質(zhì)體。如今的基因編輯技術(shù)已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)編輯時(shí)代，脫靶效應(yīng)和外源基因的定點(diǎn)插入效率等問題仍需要深入探索。此外，人們也在不斷的優(yōu)化和開發(fā)新的基因編輯技術(shù)以期應(yīng)用于家畜育種、構(gòu)建動(dòng)物疾病模型和疾病治療等各個(gè)領(lǐng)域。

綜上所述，CRISPR/Cas 系統(tǒng)具有巨大的發(fā)展空間和優(yōu)化潛能，它的編輯效率高、構(gòu)建簡單、特異性強(qiáng)等的優(yōu)勢將有助于解決畜禽種業(yè)的瓶頸問題，使我國的種業(yè)得到快速、健康和持續(xù)發(fā)展。隨著研究的逐步深入，CRISPR/Cas 系統(tǒng)仍將不斷完善和優(yōu)化，爭取在更多的領(lǐng)域獲得成果。