尹樂(lè)斌，何平，李樂(lè)樂(lè)，劉椏麗，楊學(xué)為，羅雪韻

(1.邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng) 422000；2.豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng) 422000)

豌豆(PisumsativumL.)是一種組成比較平衡優(yōu)良的植物蛋白資源[1]，不含植物性雌性激素等優(yōu)點(diǎn)，豌豆蛋白占干重的23%～25%[2]。目前，已知豌豆蛋白含有3種過(guò)敏原[3]，食用后可能造成體內(nèi)酸堿失衡、腹瀉、貧血甚至出現(xiàn)神志不清、休克等不良反應(yīng)，影響豌豆蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域，人們常采用酶解法[4]改變過(guò)敏原的線性或構(gòu)象表位制備豌豆多肽，開(kāi)發(fā)低過(guò)敏原的豌豆蛋白。豌豆多肽富含人體必需氨基酸[5]，具備易消化吸收、穩(wěn)定性強(qiáng)、促進(jìn)腸道有益菌生長(zhǎng)[6]等優(yōu)點(diǎn)，可作為恢復(fù)期患者和消化功能低下的老年人的輔助營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也可加入到各類調(diào)味品的調(diào)制中[7]。作為食品原料，豌豆多肽比豌豆蛋白具有更廣泛的應(yīng)用前景。因此，對(duì)豌豆多肽進(jìn)行開(kāi)發(fā)和研究具有一定的價(jià)值。

鐵是機(jī)體必不可少的微量元素。當(dāng)體內(nèi)缺鐵時(shí)，會(huì)造成貧血，影響兒童生長(zhǎng)、智力和運(yùn)動(dòng)的發(fā)育[8]。而傳統(tǒng)鐵補(bǔ)充劑中，一代補(bǔ)鐵劑硫酸亞鐵因釋放鐵離子快速引起惡心、嘔吐等不良反應(yīng)[9]，二代可溶性小分子有機(jī)酸-鐵鹽螯合物具有成本高[10]、二價(jià)鐵離子易不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。因此，尋找新型鐵補(bǔ)充劑是目前的研究熱點(diǎn)。當(dāng)前，食源性有機(jī)肽-亞鐵螯合物可以維持鐵以亞鐵離子的形式被人體吸收，同時(shí)具有成本低、能耗低、無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的鐵補(bǔ)充劑。畢秋蕓[11]將裙帶菜多肽與亞鐵離子螯合制備裙帶菜多肽-亞鐵螯合物，肖懷秋等[12]將花生肽與亞鐵螯合制備花生多肽-亞鐵螯合物，均擴(kuò)大了人體鐵補(bǔ)充劑的來(lái)源，豐富了補(bǔ)充劑的種類。本研究對(duì)豌豆多肽與亞鐵離子螯合制備螯合物工藝進(jìn)行優(yōu)化，并測(cè)得最佳工藝條件下豌豆多肽-亞鐵螯合物的抗氧化活性，為豌豆蛋白質(zhì)資源的充分利用以及拓寬鐵補(bǔ)充劑的來(lái)源提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白：實(shí)驗(yàn)室提取所得；堿性蛋白酶(200000 U/g)：四川合氏生物科技有限公司；抗壞血酸(分析純)：西隴科學(xué)股份有限公司；氯化亞鐵(分析純)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；1,10-菲啰啉(一水合物，分析純)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；ABTS(2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸，純度>98.0%)：合肥巴斯夫生物科技有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度>97.0%)：上海如吉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

雙列四孔恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；3H16RI臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；D-7紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 南京菲勒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 亞鐵離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參考魏冬梅等[13]的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。取0.4 mL樣品，加入pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液1 mL、1%鹽酸羥胺0.5 mL、0.1%鄰菲啰啉1 mL，定容至10 mL。采用紫外分光光度計(jì)在440～600 nm處進(jìn)行掃描，確定最佳測(cè)定波長(zhǎng)以及最佳反應(yīng)時(shí)間。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用莫爾鹽(硫酸亞鐵銨Fe(NH4)2·(SO4)2·6H2O)配制不同濃度的亞鐵離子溶液，分別加入緩沖液顯色劑，反應(yīng)一段時(shí)間后，于最佳測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，最后繪制相關(guān)性標(biāo)準(zhǔn)曲線(亞鐵離子濃度與吸光度)。

1.3.2 豌豆多肽的制備

運(yùn)用堿沉淀法[14]提取得到豌豆蛋白，稱取豌豆蛋白7.2 g，配制7.2%豌豆乳，調(diào)節(jié)pH為12，加入0.42 g堿性蛋白酶，50.5 ℃酶解2.8 h，得到豌豆蛋白酶解液，超濾得到豌豆多肽(分子量<800 Da)。

1.3.3 豌豆多肽-亞鐵螯合物的制備

稱取1.500，1.875，2.250，2.625，3.000 g豌豆多肽并加入50 mL水于錐形瓶中，調(diào)節(jié)溶液pH為6.5，添加抗壞血酸0.075，0.150，0.225，0.300，0.375 g、氯化亞鐵1.5 g，在溫度20，25，30，35，40 ℃恒溫螯合40，50，60，70，80 min，得到螯合后的樣品。

根據(jù)單因素優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，將A螯合時(shí)間、B抗壞血酸添加量、C螯合溫度、D多肽添加量作為自變量，設(shè)置低(-1)、中(0)、高(1)3個(gè)水平，以豌豆多肽與亞鐵螯合率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。通過(guò)Design-Expert軟件預(yù)測(cè)制備豌豆多肽-亞鐵螯合物的最佳工藝，最后進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。響應(yīng)面因素與水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表

1.3.4 樣品螯合率的測(cè)定

將螯合后的樣品離心(10000 r/min，10 min)，棄去上清液，加入10 mL無(wú)水乙醇洗滌，離心(10000 r/min，10 min)，得沉淀豌豆多肽-亞鐵螯合物，加入10 mL 2 mol/L鹽酸溶液水解，離心(10000 r/min，10 min)，得到含有亞鐵離子的上清液，采用鄰菲啰啉比色法測(cè)定亞鐵離子含量，通過(guò)下式計(jì)算得到多肽與亞鐵離子的螯合率。

式中：m1為螯合物中亞鐵離子含量，g；m2為加入螯合體系的亞鐵離子含量，g。

1.3.5 抗氧化活性

通過(guò)測(cè)定ABTS[15]、DPPH[16]自由基清除率來(lái)評(píng)價(jià)豌豆多肽-亞鐵螯合物的抗氧化活性。

1.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)每組重復(fù)3次，用WPS Office、SPSS、Design-Expert V8.0.6.1等軟件進(jìn)行誤差分析、繪圖、方差分析、響應(yīng)面優(yōu)化等數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄰菲啰啉法亞鐵離子標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用鄰菲羅啉法測(cè)定亞鐵離子濃度，在波長(zhǎng)440～600 nm處的掃描圖見(jiàn)圖1，發(fā)現(xiàn)測(cè)定波長(zhǎng)為510 nm時(shí)，與空白樣相比，樣品的吸光度最大；反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響見(jiàn)圖2，當(dāng)樣品與顯色劑反應(yīng)達(dá)到20 min后，增大反應(yīng)時(shí)間，樣品的吸光度變化不大，因此，選取測(cè)定波長(zhǎng)510 nm、反應(yīng)時(shí)間20 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 樣品的光譜掃描Fig.1 The spectral scanning of the sample

圖2 不同反應(yīng)時(shí)間下樣品吸光度Fig.2 The absorbance of sample at different reaction time

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得到亞鐵離子濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖3。

圖3 亞鐵離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of ferrous ion concentration

由圖3可知，溶液濃度與吸光度呈正相關(guān)，得到方程式：A=8.221x-0.0013，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，較好，可用來(lái)模擬鐵離子濃度與吸光度的關(guān)系。

2.2 豌豆多肽與氯化亞鐵制備豌豆多肽-亞鐵單因素試驗(yàn)

螯合時(shí)間對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著螯合時(shí)間延長(zhǎng)，豌豆多肽與亞鐵離子的螯合率增大，可能是螯合時(shí)間過(guò)短，反應(yīng)不充分。超過(guò)最佳螯合時(shí)間70 min后，由于體系pH值變化或螯合物穩(wěn)定性降低而導(dǎo)致螯合物的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，亞鐵離子被釋放到多肽結(jié)構(gòu)外部成為游離狀態(tài)，從而降低其螯合率[17]。因此,選擇螯合時(shí)間70 min進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 螯合時(shí)間對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響Fig.4 The effect of chelation time on pea polypeptide-ferrous chelation rate

抗壞血酸添加量對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 抗壞血酸添加量對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響Fig.5 The effect of ascorbic acid additive amount on pea polypeptide-ferrous chelation rate

抗壞血酸主要用來(lái)發(fā)揮抗氧化性，使亞鐵離子(Fe2+)避免被氧化為三價(jià)鐵離子(Fe3+)[18]。由圖5可知，當(dāng)抗壞血酸濃度較低(低于0.225 g)時(shí)，無(wú)法保證鐵以亞鐵的形式存在，所以螯合率低。當(dāng)體系中抗壞血酸含量過(guò)量時(shí)，反應(yīng)體系的酸堿值遭到破壞，造成螯合率略有下降[19]。最佳抗壞血酸添加量為0.225 g。

螯合溫度對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 螯合溫度對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響Fig.6 The effect of chelation temperature on peapolypeptide-ferrous chelation rate

由圖6可知，隨著溫度的上升，多肽分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步舒展，同時(shí)分子和離子間的熱運(yùn)動(dòng)加劇，促進(jìn)整個(gè)螯合反應(yīng)的進(jìn)行[20]。而當(dāng)溫度進(jìn)一步升高超過(guò)30 ℃時(shí)，抗壞血酸被破壞，無(wú)法維持亞鐵離子價(jià)態(tài)的穩(wěn)定，導(dǎo)致Fe2+被氧化為Fe3+，螯合率下降。豌豆多肽與亞鐵離子螯合是放熱反應(yīng)，溫度過(guò)高會(huì)抑制反應(yīng)的進(jìn)行，還會(huì)促進(jìn)亞鐵離子氧化水解生成Fe(OH)3沉淀，螯合率下降[21]。因此,選擇螯合溫度30 ℃進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

豌豆多肽添加量對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 豌豆多肽添加量對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響 Fig.7 The effect of pea polypeptide additive amount polypeptide-ferrous chelationrate on pea

豌豆多肽結(jié)合亞鐵離子的數(shù)量是一定的，當(dāng)反應(yīng)體系中多肽含量較低時(shí)，螯合物的環(huán)狀結(jié)構(gòu)極其不穩(wěn)定，影響螯合率[22]。由圖7可知，當(dāng)豌豆多肽含量超過(guò)2.625 g時(shí)，氯化亞鐵結(jié)合的位點(diǎn)有限，會(huì)造成多肽的浪費(fèi)[23]。所以,螯合最佳豌豆多肽添加量為2.625 g。

2.3 豌豆多肽與氯化亞鐵制備豌豆多肽-亞鐵響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面方案及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface analysis scheme and experimental results

續(xù) 表

4個(gè)單因素經(jīng)過(guò)回歸擬合后，得到豌豆多肽、Fe2+制備豌豆多肽-Fe2+螯合物工藝條件的二次項(xiàng)回歸方程：

螯合率(%)=+31.17+1.19A+1.26B-1.52C+1.26D+1.63AB-1.26AC-1.61AD+1.83BC-2.02BD+1.42CD-4.30A2-2.05B2-2.06C2-1.37D2。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，得出螯合率方差分析表，見(jiàn)表3。

表3 螯合率方差分析表Table 3 Analysis of variance of chelation rate

由表3可知，試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷腜<0.0001，表明模型與回歸方程顯著；螯合率的失擬項(xiàng)P=0.8421，不顯著(P>0.05)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9125，校正系數(shù)RAdj2=0.825，說(shuō)明回歸方程與實(shí)際擬合度較好，響應(yīng)面的預(yù)測(cè)值與本次試驗(yàn)測(cè)得的具體值聯(lián)系緊密，試驗(yàn)誤差小，本模型適用于預(yù)測(cè)不同螯合條件下豌豆多肽-亞鐵螯合率；由F值可知，各因素對(duì)豌豆多肽-亞鐵螯合率的影響順序?yàn)镃螯合溫度>B抗壞血酸添加量>D多肽添加量>A螯合時(shí)間。

經(jīng)軟件分析結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，該模型得到的豌豆多肽-亞鐵螯合物最佳條件為螯合時(shí)間72.72 min、抗壞血酸添加量0.25 g、螯合溫度28.2 ℃、多肽添加量2.58 g，螯合率為31.394%，與預(yù)測(cè)值差異不顯著(P>0.05)。

2.4 抗氧化活性

由圖8可知，在0～0.16 mg/mL范圍內(nèi)，隨著豌豆多肽-亞鐵螯合物質(zhì)量濃度的增加，ABTS自由基的清除率增加，0.16 mg/mL時(shí)清除率約為100%。

圖8 不同樣品對(duì)ABTS自由基清除率Fig.8 The scavenging rate of ABTS free radicals by different samples

由圖9可知，豌豆多肽-亞鐵螯合物質(zhì)量濃度在0～0.64 mg/mL范圍內(nèi)對(duì)DPPH自由基的清除率不斷增加，之后趨于穩(wěn)定。綜上所述，豌豆多肽-亞鐵螯合物對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基具有較好的清除效果。幾種不同樣品的抗氧化活性能力為：Vc(維生素C)>亞鐵離子>豌豆多肽-亞鐵螯合物>豌豆多肽，說(shuō)明螯合物將兩個(gè)原料較好地結(jié)合在一起共同發(fā)揮清除活性，與馬利華[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。經(jīng)過(guò)計(jì)算得到豌豆多肽-亞鐵螯合物對(duì)ABTS自由基、DPPH自由基的EC50(半數(shù)清除率)分別為0.084，0.268 mg/mL。

圖9 不同樣品對(duì)DPPH自由基清除率Fig.9 The scavenging rate of DPPH free radicals by different samples

3 結(jié)論

通過(guò)將豌豆多肽與亞鐵離子進(jìn)行螯合工藝優(yōu)化得到最佳螯合條件：螯合時(shí)間72.72 min、抗壞血酸添加量0.25 g、螯合溫度28.2 ℃、多肽添加量2.58 g，此時(shí)制備豌豆多肽-亞鐵螯合率為31.394%。對(duì)亞鐵離子、豌豆多肽、豌豆多肽-亞鐵螯合物、Vc進(jìn)行ABTS、DPPH自由基清除率比較，發(fā)現(xiàn)螯合物的抗氧化活性較原豌豆多肽有所提高，且具有較好的抗氧化活性。與李文軍等[25]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，證明大豆多肽鐵螯合物具備抗氧化性，有較高的生物活性，是優(yōu)質(zhì)的鐵補(bǔ)充劑。將鐵與多肽螯合研究新型貯鐵方法，有利于挖掘其在食品調(diào)味品、添加劑、保健食品等方面的潛力，擴(kuò)大其應(yīng)用前景。但目前對(duì)螯合物的螯合機(jī)制以及體外模擬口腔、胃、腸仍處于初級(jí)階段，因此后續(xù)可對(duì)螯合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征探究螯合機(jī)理，對(duì)樣品進(jìn)行動(dòng)物模擬消化研究。