金雅慧,俞華芬,李羅飛,秦 麗*
(1.杭州市余杭區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)站,杭州 311100;2.寧波工程學(xué)院,奉化研究院,浙江寧波 315500)
黃精(Polygonatirhizoma)是百合科黃精屬植物滇黃精、黃精、多花黃精的干燥植物根莖[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),黃精的化學(xué)成分主要有多糖類、甾體皂苷、三萜皂苷類、黃酮類和蒽醌類、木脂素類、植物甾醇類、氨基酸以及金屬元素類等,其中黃精多糖為主要藥效成分[2-4]?!吨腥A人民共和國(guó)藥典》(2020年版)在通則0212《藥材和飲片檢定通則》中增訂了針對(duì)控制農(nóng)藥殘留污染的內(nèi)容,要求藥材和飲片(植物類)中不得檢出33種禁用農(nóng)藥[5]。甲胺磷(Methamidophos),化學(xué)式為C2H8NO2PS,屬于廣譜緩釋有機(jī)磷類殺蟲(chóng)劑,具有良好的內(nèi)吸、胃毒和觸殺作用,廣泛用于各種農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治[6],是通則0212中規(guī)定的不得檢出的禁用農(nóng)藥之一。
測(cè)量不確定度是一種對(duì)測(cè)量/檢測(cè)結(jié)果可疑程度的定量表述方法,能反映檢測(cè)人員、測(cè)量?jī)x器設(shè)備和檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件等的測(cè)量能力、水平。我國(guó)GB/T 27025—2019《檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力的通用要求》[7]和RB/T 214—2017《檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評(píng)價(jià)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)通用要求》[8]中規(guī)定:檢測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室都必須進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)定,且應(yīng)在具體的檢測(cè)和校準(zhǔn)工作中應(yīng)用這些程序來(lái)進(jìn)行測(cè)量不確定度的評(píng)定,并能運(yùn)用測(cè)量不確定度評(píng)定的結(jié)果來(lái)判定檢測(cè)結(jié)果是否符合規(guī)定要求以及對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)或測(cè)量過(guò)程實(shí)施監(jiān)控。目前,已有相關(guān)文獻(xiàn)[9-12]采用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機(jī)磷、有機(jī)氯、擬除蟲(chóng)菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測(cè)定》[13]測(cè)定蔬菜、水果中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的不確定度,如采用氣相色譜測(cè)定鮮枸杞中農(nóng)藥氧樂(lè)果殘留的不確定度評(píng)定[14];采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定三七中農(nóng)藥腐霉利含量的不確定度評(píng)定[15]等,而采用《中國(guó)藥典》(2020年版)通則2341《農(nóng)藥殘留測(cè)定法》[16]測(cè)定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度評(píng)定未見(jiàn)報(bào)道。本文按照《中國(guó)藥典》通則2341《農(nóng)藥殘留測(cè)定法》中《第二法有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量測(cè)定法(色譜法)》[16],并參照J(rèn)JF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[17]及JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[18],對(duì)黃精中甲胺磷殘留檢測(cè)過(guò)程中各不確定度分量進(jìn)行來(lái)源分析和計(jì)算評(píng)定,以期為提升檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供有效依據(jù),同時(shí)為使用氣相色譜測(cè)定黃精中其他有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的不確定度評(píng)定提供參考。
乙酸乙酯、無(wú)水硫酸鈉、正己烷,以上均為分析純,無(wú)錫市晶科化工有限公司;濾膜(0.22μm),北京萊博潤(rùn)科生物科技有限公司;石墨化炭黑固相萃取SPE小柱(250 mg/3 mL),廣州太瑋生物科技有限公司;甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品1 000μg/mL(純度99.9%),農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所。
K-600型商用食品加工器,德國(guó)博朗公司;PL 202-L型電子天平,梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司;S10200-A型超聲波清洗器,天津奧特塞恩斯公司;AR-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,瑞士布奇公司;MS-3漩渦混合器,德國(guó)艾卡公司;N-EVAP 12位氮吹儀,美國(guó)Organomation公司;Agilent 7890A型氣相色譜儀(FPD檢測(cè)器),美國(guó)安捷倫公司。
1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
準(zhǔn)確移取0.5 mL甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品1 000μg/mL,用乙酸乙酯定容于50 mL玻璃容量瓶中,得到甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10.0 mg/L。準(zhǔn)確移取0.5 mL上述甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙酸乙酯定容于50 mL玻璃容量瓶中,得到0.1 mg/L甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液,再分別移取0.5、1.0、2.0、5.0 mL上述甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用乙酸乙酯定容于10 mL玻璃容量瓶中,得到0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液。甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)曲線系列質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L。
1.3.2 氣相色譜條件
色譜柱:HP-5(30 mm×0.32 mm×0.25μm);載氣:N2(純度99.99%);進(jìn)樣口溫度:220℃;進(jìn)樣模式:不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣體積:1.0μL;恒流模式:流速3.53 mL/min;檢測(cè)器溫度:250℃;尾吹60 mL/min,燃?xì)?5 mL/min,助燃?xì)?00 mL/min;程序升溫:60℃(保持2 min),5℃/min升溫至250℃(保持2 min)。
1.3.3 樣品前處理
采用《中國(guó)藥典》(2020年版)通則2341中第二法的前處理方法[16],稱取粉末黃精試樣5 g,加入無(wú)水硫酸鈉5 g、乙酸乙酯50 mL,于冰浴中超聲3 min,靜置15 min后收集上層濾液,加入乙酸乙酯30 mL至固體部分,于冰浴中超聲2 min,靜置15 min后收集上層濾液;合并上述上層濾液,使用少量乙酸乙酯沖洗濾紙及固體部分,并入上述濾液。將濾液于40℃以下濃縮近干,轉(zhuǎn)移至5 mL玻璃試管中,使用乙酸乙酯稀釋至5 mL;吸取上述溶液1 mL,上樣至石墨化炭黑固相萃取SPE小柱(乙酸乙酯5 mL預(yù)淋);使用正己烷-乙酸乙酯(1∶1,V/V)混合液5 mL進(jìn)行洗脫;收集洗脫液,氮吹濃縮近干,用乙酸乙酯定容至1 mL,渦旋混勻后,過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜至進(jìn)樣瓶,供氣相色譜儀測(cè)定。
1.3.4 數(shù)學(xué)模型的建立
構(gòu)建的數(shù)學(xué)模型為乘除形式,可用相對(duì)不確定度評(píng)定,無(wú)需計(jì)算靈敏度系數(shù)。樣品中被測(cè)農(nóng)藥甲胺磷的殘留量按式(1)計(jì)算。
式中:x為黃精中甲胺磷的殘留量,mg/kg;Va為提取溶劑(乙酸乙酯)的總體積,mL;Vb為用于檢測(cè)的提取溶液的體積,mL;Vc為樣品溶液處理后定容的體積,mL;cref為標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲胺磷質(zhì)量濃度,μg/mL;A、As分別為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲胺磷峰面積的平均值,mAU·s;m為樣品的質(zhì)量,g;R為樣品加標(biāo)回收率,%;fr為樣品均勻性校正因子,取值為1。
黃精中甲胺磷殘留量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成按式(2)計(jì)算。
式中:urel(rep)為檢測(cè)過(guò)程總重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)不確定度,是由氣相色譜儀峰面積A、As、稱量、移取溶液、定容等操作的重復(fù)性分量合并而成的一個(gè)總檢測(cè)過(guò)程中的分量,利用X重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差;urel(crep)為甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度;urel(sv)為甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)不確定度;urel(m)為黃精樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度;urel(Va)、urel(Vb)、urel(Vc)分別為樣品提取液、用于檢測(cè)的提取液、樣品溶液處理后定容產(chǎn)生的相對(duì)不確定度;urel(R)為方法回收率產(chǎn)生的相對(duì)不確定度;urel(fr)為黃精樣品的均勻性校正因子fr產(chǎn)生的相對(duì)不確定度;urel(A)為氣相色譜峰面積測(cè)量值產(chǎn)生的相對(duì)不確定度。
從數(shù)學(xué)模型、前處理過(guò)程、檢測(cè)原理等方面分析,用氣相色譜法測(cè)定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度來(lái)源,如圖1所示。
圖1 不確定度來(lái)源
2.2.1 檢測(cè)過(guò)程總重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(rep)
分別稱取10份黃精樣品,按1.3試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定殘留量x,按貝塞爾公式,即式(3)計(jì)算x的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差s(x),重復(fù)測(cè)定檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 重復(fù)測(cè)定檢測(cè)結(jié)果(n=10)
實(shí)際測(cè)量時(shí),一般將對(duì)樣品測(cè)定2次作為測(cè)量結(jié)果,則檢測(cè)過(guò)程總重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(rep)按式(4)計(jì)算。
2.2.2 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(crep)
2.2.2.1 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品濃度cs產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(cs)
使用有證標(biāo)準(zhǔn)品,甲胺磷質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)值為1 000μg/mL,標(biāo)準(zhǔn)品證書(shū)記錄甲胺磷不確定度為3%,即±30μg/mL(k=2),甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
2.2.2.2 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過(guò)程中由玻璃量器、液體體積膨脹產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(Vi)(i=1~5)
根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[19]規(guī)定:1、2、5 mL玻璃分度移液管(A級(jí))的最大允許誤差(MPE)分別為±0.008、±0.012、±0.025 mL,按照均勻分布處理玻璃單標(biāo)線容量瓶的MPE值分別為±0.020、±0.050 mL,按照三角分布處理查詢本實(shí)驗(yàn)室當(dāng)日環(huán)境控制記錄,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度在(20±5)℃,與常用玻璃量器的檢定校準(zhǔn)溫度(20℃)[19]不同,溫度變化產(chǎn)生的不確定度可通過(guò)估算溫度變化范圍,體積膨脹系數(shù)來(lái)計(jì)算。因常用有機(jī)溶劑的體積膨脹系數(shù)遠(yuǎn)高于常用玻璃量器的體積膨脹系數(shù),故只須考慮常用有機(jī)溶劑的體積膨脹。乙酸乙酯體積膨脹系數(shù)為1.38×10-3/℃,按照均勻分布處理
使用分度移液管、單標(biāo)線容量瓶等稀釋配制甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液過(guò)程中,有2個(gè)主要不確定度來(lái)源:最大允許誤差和溫度影響,且這2個(gè)分量互不相關(guān),其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以采用方和根方法合成,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可采用合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度除以所量取體積進(jìn)行估算。結(jié)果如下:
2.2.2.3 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(crep)
在甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中,使用1 mL分度移液管(A級(jí))吸取0.5 mL(V1-0.5)液體2次,吸取1 mL(V1-1)液體1次;使用A級(jí)2、5 mL分度移液管吸取2 mL(V2)液體1次、5 mL(V3)液體1次;使用10 mL(V4)、50 mL(V5)單標(biāo)線容量瓶次數(shù)分別為4、1次,合成甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(crep)按式(5)計(jì)算。
2.2.3 甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(sv)
對(duì)質(zhì)量濃度為0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/L的甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,以甲胺磷質(zhì)量濃度c為橫坐標(biāo),氣相色譜測(cè)得的峰面積y為縱坐標(biāo),采用最小二乘法進(jìn)行線性擬合,得到擬合直線方程y=ac+b為y=5 037.1c+57.954(R2=0.999 9)(表2)。
表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線校正引入的相對(duì)不確定度
標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積的余差標(biāo)準(zhǔn)偏差Sy按式(6)計(jì)算。
標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度urel(sv)按式(7)計(jì)算。
式中:c0為被測(cè)樣品質(zhì)量濃度的平均值,取值為0.213 mg/L;cˉ為甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中各質(zhì)量濃度的平均值,取值為1.72 mg/L;ci為甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中的一系列質(zhì)量濃度值,mg/L;a為擬合直線方程中的斜率,取值為5 037.1;b為直線截距,取值為57.954;n為作擬合直線方程時(shí)甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)(每個(gè)濃度測(cè)定2次),取值為10;p為黃精樣品測(cè)定次數(shù),取值為2。
2.2.4 樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(m)
用電子天平稱量黃精樣品,電子天平檢定合格。經(jīng)查詢?cè)撎炱組PE值為±0.05 g,按均勻分布處理,稱量采用去皮法,則樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(m)按式(8)計(jì)算。
2.2.5 樣品提取液、用于檢測(cè)的提取液、樣品溶液處理后定容產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(Va)、urel(Vb)、urel(Vc)
根據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃器檢定規(guī)程》[19]規(guī)定:5 mL刻度試管、1 mL分度移液管(A級(jí))的MPE值分別為±0.100、±0.008 mL,按照均勻分布處理,實(shí)驗(yàn)室溫度在(20±5)℃,乙酸乙酯體積膨脹系數(shù)為1.38×10-3/℃,按照均勻分布處理
使用分度移液管吸取樣品提取液、用于檢測(cè)的提取液、樣品溶液處理后定容等過(guò)程中,有2個(gè)主要不確定度來(lái)源:最大允許誤差和溫度影響,且這2個(gè)分量互不相關(guān),其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以采用方和根方法合成,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度可采用合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度除以所量取體積進(jìn)行估算。結(jié)果如下:
式中:因樣品溶液處理后是在5 mL刻度試管中定容至1 mL,故MPE取值為0.100,并以此計(jì)算urel(Vc)。
2.2.6 方法回收率產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(R)
使用5份陰性樣品做加標(biāo)試驗(yàn),甲胺磷添加濃度為0.010 mg/kg,得回收率(R)分別為102.2%、101.4%、99.0%、100.6%、99.8%,平均回收率(R)為100.6%。
采用A類不確定定評(píng)定中的極差法進(jìn)行評(píng)定回收率產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(R)。查詢JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[18]中極差系數(shù)及自由度表可知,當(dāng)測(cè)量次數(shù)n=5時(shí),極差系數(shù)C=2.33,按式(9)計(jì)算urel(R)。
通過(guò)t檢驗(yàn),判斷回收率(R)是否與100%存在顯著差異。查詢t值表,在置信率P=95%,t0.95(4)=2.780,按式(10)計(jì)算檢驗(yàn)值t。
由此說(shuō)明,回收率(R)不必在測(cè)量模型中采用修正測(cè)定結(jié)果,但其對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)需考慮。
2.2.7 樣品的均勻性校正因子(fr)產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(fr)
根據(jù)本文所采用的檢測(cè)方法,平行配制3份黃精樣品,在氣相色譜儀上進(jìn)行測(cè)定,得到測(cè)定數(shù)據(jù)x′為0.506、0.510、0.503 mg/kg,xˉ′為0.506 mg/kg。
采用A類不確定度評(píng)定中的極差法進(jìn)行評(píng)定。查詢JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[18]中極差系數(shù)及自由度表可知,當(dāng)測(cè)量次數(shù)n=3時(shí),極差系數(shù)C=1.69。
因樣品測(cè)定以2次測(cè)量平均值為其測(cè)量結(jié)果,則樣品的均勻性校正因子產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(fr)按式(11)計(jì)算。
2.2.8 氣相色譜峰面積測(cè)量值產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(A)
2.2.8.1 氣相色譜進(jìn)樣體積產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(Ve)
由1.3.2氣相色譜條件可知,氣相色譜進(jìn)樣體積為1.0μL,查詢氣相色譜儀進(jìn)樣微量注射器說(shuō)明書(shū),其定量重復(fù)性為1.0%,即其重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
2.2.8.2 氣相色譜FPD檢測(cè)器產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(A)1
查詢氣相色譜檢定證書(shū)可知,定量重復(fù)性為1.3%,按照矩形分布處理采用B類不確定度評(píng)定,則氣相色譜FPD檢測(cè)器產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為
2.2.8.3 氣相色譜峰面積響應(yīng)值產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(A)2
儀器對(duì)在相同色譜條件下所測(cè)樣品和甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響是一致的,因此氣相色譜峰面積響應(yīng)值產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(A)2可忽略不計(jì),氣相色譜峰面積的重復(fù)性已在檢測(cè)過(guò)程總重復(fù)性中納入考慮。
2.2.8.4 氣相色譜峰面積測(cè)量值產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(A)
峰面積測(cè)量值產(chǎn)生的相對(duì)不確定度urel(A)按式(12)計(jì)算。
上述各項(xiàng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3,通過(guò)各項(xiàng)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成得到黃精樣品中甲胺磷殘留量的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
表3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量統(tǒng)計(jì)結(jié)果
黃精樣品中甲胺磷殘留量在實(shí)際2次測(cè)量的平均值x為0.213 mg/kg,則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式(13)計(jì)算。
根據(jù)JJF 1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[17],在95%置信概率下,包含因子k=2,則擴(kuò)展不確定度按式(14)計(jì)算。
當(dāng)測(cè)得黃精中甲胺磷殘留量為0.213 mg/kg時(shí),其測(cè)量結(jié)果表示為0.213±0.017 mg/kg,k=2。
本研究采用氣相色譜法測(cè)定黃精中甲胺磷殘留量的不確定度,并對(duì)整個(gè)定量檢測(cè)過(guò)程中可能產(chǎn)生的各種不確定度分量進(jìn)行來(lái)源分析、計(jì)算評(píng)定。由分析結(jié)果可知,甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的不確定度分量相對(duì)貢獻(xiàn)較大,黃精樣品稱量、前處理過(guò)程中各所涉液體體積、方法的回收率、樣品的均勻性校正因子等不確定度分量貢獻(xiàn)相對(duì)較小。因此,在進(jìn)行農(nóng)藥殘留定量檢測(cè)過(guò)程中,可通過(guò)判斷選擇合適的玻璃量具,并定期做好各玻璃量具的檢定和校準(zhǔn)工作。同時(shí),應(yīng)控制好檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境條件,以及通過(guò)質(zhì)量監(jiān)督、能力驗(yàn)證、人員比對(duì)等質(zhì)量管理措施,不斷提高實(shí)驗(yàn)操作人員的操作能力水平,以期達(dá)到降低檢測(cè)結(jié)果測(cè)量不確定度的目的,確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠。