錢(qián)良友 伍冰冰 向大位

摘要：目的 ?建立阿奇霉素微生物限度檢查方法。方法 ?按《中國(guó)藥典》2020版四部生物檢查法進(jìn)行試驗(yàn)。加入銅綠假單胞菌等5個(gè)試驗(yàn)菌，測(cè)定回收率。結(jié)果 ?需氧菌總數(shù)采用薄膜過(guò)濾法，霉菌和酵母菌總數(shù)采用傾注法，各試驗(yàn)菌回收率均在0.5～2.0范圍，控制菌檢查方法可行。結(jié)論 ?本試驗(yàn)建立的方法可用于阿奇霉素微生物限度檢查。

關(guān)鍵詞：阿奇霉素、方法適用性、回收率、薄膜過(guò)濾法、傾注法

【中圖分類(lèi)號(hào)】 F763 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A ? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）06--02

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To establish a method for microbial limit test of azithromycin. METHODS：The test was carried out according to the biological examination method of ?the ?fourth part of ?the 2020 edition of Chinese Pharmacopoeia principles. The recovery rate was determined by adding 5 experimental bacteria such as Pseudomonas aeruginosa.RESULTS：The total number of aerobic bacteria was membrane filtration method， and the number of mold and yeastwas pouring method. The recovery rate of each test bacteria was in the range of 0.5～ 2.0. The method of controlbacteria examination was feasible.CONCLUSION： The established method can be used for the microbial limit test of azithromycin.

KEYWORDS Azithromycin; Method applicability recovery; Membrane fitration;Pour method

阿奇霉素屬于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的第二代抗生素[1]，抗菌譜廣泛，尤其對(duì)需氧菌和厭氧菌的抗菌能力更加顯著，為臨床應(yīng)用帶來(lái)了活力[2-3]。用于治療化膿性鏈球菌引起的急性咽炎或者是扁桃體炎或者是敏感細(xì)菌引起的鼻竇炎、中耳炎、急性支氣管炎以及慢性支氣管炎急性發(fā)作時(shí)的一種藥物[4]。阿奇霉素因具有強(qiáng)力殺滅病原微生物的作用在臨床治療中廣泛應(yīng)用，對(duì)其治療機(jī)制的分析和探討發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素一方面通過(guò)殺滅病原微生物來(lái)降低感染引起的炎癥反應(yīng)、平息免疫活化，表現(xiàn)出對(duì)先天免疫系統(tǒng)中性粒細(xì)胞趨化和巨噬細(xì)胞極化的影響，另一方面以某種機(jī)制對(duì)后天免疫系統(tǒng)的 T 細(xì)胞活化和細(xì)胞因子表達(dá)有顯著調(diào)節(jié)作用[4]。隨著阿奇霉素在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，為使臨床用藥更加安全有效，實(shí)施微生物限度檢查是確保藥品衛(wèi)生質(zhì)量的重要途徑。

本研究參考《中國(guó)藥典》2020年版四部生物檢查法[5]，建立了阿奇霉素的微生物限度檢查方法，該方法可為其他大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素藥物微生物限度檢查法的建立提供參考，同時(shí)為藥品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)及生產(chǎn)企業(yè)建立品種2020年版藥典微生物限度檢查法提供借鑒。

1. 儀器和材料

1.1儀器

YXQ-LS-100G立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）;BSP-150生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）;BMJ-400C霉菌培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）。

1.2供試品

阿奇霉素（批號(hào)：C08-202101001、C08-202101003、C08-202109001）生產(chǎn)商為黃石世星

1.3菌種

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，以上菌種均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4培養(yǎng)基

pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，批號(hào)2001092;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)190827;胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，批號(hào)190815;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)190509;沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，批號(hào)2010092;麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，批號(hào)201223;麥康凱瓊液體培養(yǎng)基，批號(hào)2018042。（以上培養(yǎng)基均來(lái)源于北京三藥技術(shù)有限責(zé)任公司。）

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1菌液的制備

參照2020年版《中國(guó)藥典》四部通則1105微生物計(jì)數(shù)法項(xiàng)下方法制備。將陽(yáng)性菌菌液稀釋10-3～10-7倍，使菌落數(shù)不大于100cfu/ml。

2.2 供試液的制備

取阿奇霉素10g，加入pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml中，混勻，即得供試液Ⅰ（100mg/ml）;再用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋?zhuān)瑒e配制成供試液Ⅱ（20mg/ml）、供試液Ⅲ（10mg/ml）、供試液Ⅳ（5mg/ml），備用。

2.3 計(jì)算公式及接受標(biāo)準(zhǔn)

試驗(yàn)組比值=（試驗(yàn)組菌落數(shù)-供試品對(duì)照組菌落數(shù)）/菌液對(duì)照組菌落數(shù)。

所得比值均應(yīng)在0.5～2.0范圍內(nèi)。

2.4微生物總數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證

2.4.1需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)（預(yù)試驗(yàn)）：分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌為試驗(yàn)菌，分別對(duì)供試液進(jìn)行處理。①分別取供試液Ⅱ和Ⅲ各1ml，用0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液沖洗1000ml，每次100ml。②取供試液Ⅳ1ml，加置100ml 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液中，全量通過(guò)一次性薄膜過(guò)濾器后，再用0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液沖洗400ml，每次100ml，沖洗最后100ml時(shí)加入菌懸液。

2.4.2霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)（預(yù)試驗(yàn)）：以黑曲霉菌和白色念珠菌為試驗(yàn)菌，分別采用2種方法對(duì)供試品進(jìn)行試驗(yàn)。①取供試液Ⅰ1ml平皿法測(cè)定;②取供試液Ⅰ1ml，采用0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液500ml薄膜過(guò)濾沖洗，沖洗最后100ml時(shí)加入菌懸液。結(jié)果見(jiàn)表1：

2.5微生物計(jì)數(shù)方法適用性

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，確認(rèn)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)使用方法②，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)使用方法①。根據(jù)此結(jié)論進(jìn)行三次平行試驗(yàn)[5]確認(rèn)。

2.5.1試驗(yàn)組：需氧菌總數(shù)取供試液Ⅳ1ml，加置100ml 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液中，全量通過(guò)一次性薄膜過(guò)濾器后，再用400ml 0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液沖洗4次，每次100ml，沖洗最后100ml時(shí)加入小于100cfu菌懸液的1ml，沖洗后取出貼膜于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，每株試驗(yàn)菌平行制備兩個(gè)平皿，置30～35℃培養(yǎng)3～5天;霉菌和酵母菌總數(shù)取供試液Ⅰ1ml，置無(wú)菌平皿中，注入15～20ml溫度不超過(guò)45℃溶化的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，每株試驗(yàn)菌平行制備兩個(gè)平皿。置20～25℃培養(yǎng)5天，逐日觀察結(jié)果。

2.5.2供試品對(duì)照組：取不加入菌液的供試液，同法測(cè)定其微生物數(shù)。

2.5.3菌液對(duì)照組：取稀釋液代替供試液，同法操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。

結(jié)果：5株需氧菌、2株真菌的回收比值均在0.5～2之間，符合藥典規(guī)定，因此可照此方法進(jìn)行阿奇霉素膠囊的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)。見(jiàn)表2。

2.6控制菌檢查方法的驗(yàn)證

根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版要求，控制菌檢查只需檢查大腸埃希菌。

試驗(yàn)組：取供試液Ⅰ 10mL，用微生物限度檢驗(yàn)儀立即過(guò)濾，再用500ml的0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液沖洗5次（100ml/次），在最后一次沖洗液中加入不大于100cfu的大腸埃希菌菌懸液1ml，過(guò)濾后，取出濾膜接種至100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

菌液對(duì)照組：取不大于100cfu的大腸埃希菌，接種至100ml的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。

陰性對(duì)照組：取0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液500ml薄膜過(guò)濾沖洗后，濾膜接種置100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。均按藥典方法培養(yǎng)。

結(jié)果：控制菌選用稀釋10-6倍的大腸埃希菌，三批供試品進(jìn)行三次平行驗(yàn)證，結(jié)果為試驗(yàn)組和陽(yáng)性組均檢出大腸埃希菌生長(zhǎng)，而陰性組均未檢出，表明適用性試驗(yàn)符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

通過(guò)上述一系列試驗(yàn)，驗(yàn)證阿奇霉素對(duì)真菌無(wú)抑制作用，因此，采用傾注法進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。試藥對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有強(qiáng)抑制作用，對(duì)于抑菌作用較強(qiáng)的供試品，應(yīng)盡量選用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行試驗(yàn)[6]。阿奇霉素對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌都較敏感，因此本次驗(yàn)證中需氧菌總數(shù)通過(guò)提高稀釋倍數(shù)+薄膜過(guò)濾來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證（取1︰200的供試液1mL，每膜沖洗500mL，100mL/次）。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，大腸埃希菌檢查采用薄膜過(guò)濾法（每膜沖洗500mL，100mL/次），可有效消除供試品自身殺菌和抑菌作用，與不加供試液的陽(yáng)性對(duì)照比較，生長(zhǎng)正常。

檢查方法中干擾因素較多，易影響計(jì)數(shù)結(jié)果，如培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、加菌濃度及加菌量等[7-8]。采用薄膜過(guò)濾法試驗(yàn)時(shí)，先將供試液加至100ml沖洗液中，可使含量均勻，避免藥液中少量沉淀而堵塞濾膜導(dǎo)致過(guò)濾困難，更有利于供試液中微生物的回收。

參考文獻(xiàn)：

[1] 阿奇霉素的免疫治療機(jī)制[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021 年第 37 卷1768-1771.

[2]許銀芝，申超宇. 大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素應(yīng)用的調(diào)查分析 [J].中國(guó)藥業(yè)， 2002， 11（2）： 63.

[3]劉素霞.阿奇霉素的藥理及其臨床應(yīng)用觀察[J].甘肅科技，2014，30（21）：129-130.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典（四部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版2020.

[5] SHI J，LIU Y，ZHANG Y，et al. PA5470 counteracts antimicro‐bial effect of azithromycin by releasing stalled ribosome in pseudo‐monas aeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother.2018，62（2）

[6] 陳偉盛， 關(guān)倩明， 朱榮峰， 等. 藥品微生物限度檢查中微生物污染的鑒定和溯源分析 [J]. 藥物分析雜志， 2014， 34（1）：58-63.

[7] 殷建國(guó). 微生物限度檢查應(yīng)注意的若干問(wèn)題 [J]. 中國(guó)藥事，2004， 18（7）： 456.

[8] WEINBERGER M，LESSER D. Diffuse panbronchiolitis：A progressive fatal lung disease that is curable with azithromycin，butonly if diagnosed[J].Pediatr Pulmonol，2019，54（4）：457-462. DOI：10. 1002/ ppul. 24226.