馬建民 陳可藝 張蕓苒

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102401

揮發(fā)油成分不溶于水，水提取效率低，提取液中添加環(huán)糊精，能增加揮發(fā)油類成分在水中的溶解度[7]。高壓熱水提取法常用于植物中多糖的提取，其原理為利用高壓對(duì)細(xì)胞的破碎作用，有利于熱水從胞內(nèi)溶出多糖[8]。王廣慧等[9]使用高壓熱水對(duì)金針菇進(jìn)行提取，其黃酮提取率達(dá)12.7%。為了更充分利用牛至資源，本文提出了在密封容器中用高壓熱水環(huán)糊精溶液浸提牛至的新方法，其優(yōu)點(diǎn)有：密封環(huán)境，避免牛至中揮發(fā)油類成分的揮發(fā)；浸提在高溫高壓下進(jìn)行，縮短浸提時(shí)間；浸提過(guò)程也是滅菌過(guò)程，延長(zhǎng)產(chǎn)品保存時(shí)間；環(huán)糊精浸提液可同時(shí)含有牛至揮發(fā)油類成分和水溶性有效成分；生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，浸提過(guò)程不使用有機(jī)溶劑；牛至與浸提液可不經(jīng)分離，直接拌飼使用。通過(guò)測(cè)定牛至高壓熱水浸提液中揮發(fā)油類成分香芹酚含量和浸提液抗氧化活性，優(yōu)化牛至高壓熱水浸提工藝，以期能為合理開(kāi)發(fā)牛至資源開(kāi)辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料試劑及儀器設(shè)備

1）材料：牛至藥材，購(gòu)自玉林市玉州區(qū)菩提藥源食品經(jīng)營(yíng)部。

2）試劑：環(huán)糊精（食品級(jí)，購(gòu)自孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司）、乙腈（色譜純，F(xiàn)isherScientific公司）、2,2-聯(lián)氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），過(guò)硫酸鉀（購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），香芹酚對(duì)照品（＞99.0%，Macklin 公司）。

3）儀器設(shè)備：上海申安醫(yī)用高壓滅菌鍋LDZX-50KBS、島津高效液相色譜儀LC-16AT、多功能酶標(biāo)儀SpectraMax i3x。

1.2 試驗(yàn)方法

1）牛至的高壓熱水浸提方法及待測(cè)液制備。牛至粉碎，過(guò)0.425 mm 篩，制成牛至粉。精確稱取牛至粉7.5 g，至50 mL 細(xì)口瓶中，加42.5 mL 環(huán)糊精溶液，用膠塞和鋁蓋密封，然后進(jìn)行高壓熱水浸提，制備浸提液。

取適量浸提液8 000 r/min 離心10 min，上清液過(guò)0.25 μm 微孔濾膜，取濾液0.4 mL，加乙腈0.6 mL，混勻，8 000 r/min 離心10 min，過(guò)0.25 μm微孔濾膜，制備待測(cè)液。

2）高壓熱水浸提液中香芹酚含量測(cè)定。采用高效液相色譜法測(cè)牛至高壓熱水浸提液中香芹酚含量，待測(cè)液進(jìn)樣量10 μL，標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性回歸方程的獲得方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

3）高壓熱水浸提液抗氧化性能測(cè)定。ABTS 陽(yáng)離子溶液配制：精密稱取ABTS 試劑200.0 mg，至50 mL 容量瓶中，用純化水定容，搖勻得A 液；精密稱取過(guò)硫酸鉀35.0 mg，至50 mL 容量瓶中，用純化水定容，搖勻得B 液。A 液與B 液混合，在室溫黑暗處反應(yīng)12～16 h，得ABTS 陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液。再用乙腈稀釋ABTS 陽(yáng)離子自由基儲(chǔ)備液，使其在734 nm 測(cè)吸光度值為0.9±0.1，即得ABTS 陽(yáng)離子溶液。

取待測(cè)液10 μL，加乙腈1 mL，混勻，8 000 r/min離心10 min，上清液過(guò)0.25 μm 微孔濾膜，依次取0、20、40、60、80、100、120 μL 上清液置96 孔板中，依次加入乙腈120、100、80、60、40、20、0 μL，混勻，使各孔均為120 μL，分別加入ABTS 陽(yáng)離子溶液120 μL，避光室溫反應(yīng)6 min，734 nm 測(cè)定吸光值。根據(jù)以下公式計(jì)算ABTS 自由基清除率，并計(jì)算出半數(shù)抑制率IC50值。

式中：為牛至浸提液對(duì)ABTS 自由基的清除率； 為ABTS 自由基空白對(duì)照的吸光度值； 為浸提液與ABTS 自由基反應(yīng)后的吸光度值。

4）高壓熱水浸提牛至工藝單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別研究浸提溫度（106、109、112、115、118、121 ℃）、不同環(huán)糊精濃度（0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、浸提時(shí)間（15、20、25、30、35、40 min）對(duì)牛至香芹酚含量和ABTS 自由基清除率的影響。

5）高壓熱水浸提牛至正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，用L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，研究提取溫度、提取時(shí)間、環(huán)糊精濃度對(duì)香芹酚含量和ABTS 自由基清除率的影響，對(duì)牛至高壓熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素分析

1）溫度對(duì)浸提影響。固定環(huán)糊精濃度為1%，浸提時(shí)間為30 min，不同溫度，浸提液香芹酚含量和ABTS 自由基IC50值見(jiàn)表1。由表1可知，不同溫度牛至浸提液中香芹酚含量呈現(xiàn)波動(dòng)變化，ABTS 自由基IC50值先降低后升高，112 ℃時(shí)IC50為91.82 μL，此浸提液抗氧化能力最強(qiáng)。

表1 溫度對(duì)浸提液的影響

2）時(shí)間對(duì)浸提影響。固定環(huán)糊精濃度為1%，浸提溫度為121 ℃，不同浸提時(shí)間，浸提液香芹酚含量和ABTS 自由基IC50值見(jiàn)表2。由表2可知，不同時(shí)間牛至浸提液中香芹酚含量呈現(xiàn)波動(dòng)變化，ABTS 自由基IC50 值先降低后升高，浸提時(shí)間為20 min 時(shí)IC50 為88.99 μL，此浸提液抗氧化能力最強(qiáng)。

表2 時(shí)間對(duì)浸提液的影響

3）環(huán)糊精濃度對(duì)浸提影響。固定浸提溫度為121 ℃，提取時(shí)間為30 min，不同環(huán)糊精濃度，浸提液香芹酚含量和ABTS 自由基IC50值見(jiàn)表3。由表3可知，牛至浸提液中香芹酚含量和抗氧化能力隨環(huán)糊精濃度增加而增大，環(huán)糊精濃度為1.0%時(shí)，香芹酚含量最高為13.148 mg/L、ABTS 自由基IC50最低為91.58 μL。

表3 環(huán)糊精濃度對(duì)浸提液的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇對(duì)牛至浸提液香芹酚含量和ABTS 自由基IC50影響較大的因素和水平進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、表6。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表L9（34）

由表5可知，A=3.274＞ e=1.851、B=0.405＜e=1.851、C=0.549＜ e=1.851，環(huán)糊精濃度因素對(duì)牛至浸提液中香芹酚含量的影響是可靠的，最佳環(huán)糊精濃度為1%；浸提時(shí)間和溫度對(duì)牛至浸提液中香芹酚含量影響不明顯。

由表6可知，C＞B＞A＞ e=1.643，各因素對(duì)浸提液ABTS 自由基IC50影響大小依次為浸提溫度（C）、浸提時(shí)間（B）、環(huán)糊精濃度（A）。由表5、表6確定最佳提取工藝為C2B2A3，即浸提溫度為112 ℃、浸提時(shí)間為20 min、浸提液環(huán)糊精濃度為1%，在此條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3 次，得到浸提液香芹酚含量為（13.545±0.514）mg/mL，ABTS 自由基IC50為（80.45±3.24）μL。

表5 正交試驗(yàn)香芹酚含量結(jié)果

表6 正交試驗(yàn)ABTS 自由基IC50 結(jié)果

3 討 論

3.1 各因素對(duì)浸提液香芹酚含量的影響

香芹酚為揮發(fā)油類脂溶性成分，β-環(huán)糊精具有“內(nèi)親油，外親水”的空腔結(jié)構(gòu)，具有促進(jìn)植物中非極性小分子的溶出作用[11]。β-環(huán)糊精濃度對(duì)浸提液中香芹酚含量影響顯著，環(huán)糊精濃度增大，香芹酚含量顯著提高。β-環(huán)糊常溫在水中溶解度為1.1%，因此，選擇浸提液的最高環(huán)糊精溶度為1%。提取溫度和提取時(shí)間對(duì)浸提液中香芹酚含量影響不顯著，可能因?yàn)橄闱鄯邮切》肿訐]發(fā)性成分，在較高溫度下，改變溫度和時(shí)間對(duì)其浸出影響不顯著。

3.2 各因素對(duì)浸提液抗氧化活性的影響

各因素對(duì)浸提液抗氧化活動(dòng)均具有顯著影響。浸提溫度和時(shí)間對(duì)浸出液抗氧化活性影響呈現(xiàn)雙重作用，即溫度過(guò)高或過(guò)低、時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)，ABTS自由基IC50值增均大，其可能原因是存在不穩(wěn)定抗氧化活性物質(zhì)，提高溫度和浸提時(shí)間增加抗氧化活性成分的溶出，但溫度過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致部分抗氧化活性成分結(jié)構(gòu)破壞而失去活性。環(huán)糊精增加非極性小分子的溶出作用，隨著環(huán)糊精濃度增加，香芹酚類成分溶出增多，浸出液抗氧化活性增大。

3.3 浸提液香芹酚含量與抗氧活性關(guān)系

由表3可知，香芹酚含量增加，浸出液抗氧化活性增大，香芹酚具有抗氧化活性。由表1、表2可知，香芹酚含量無(wú)顯著變化，抗氧化活性呈現(xiàn)曲線變化，提示浸提液含有其他抗氧化活性物質(zhì)。

4 結(jié) 論

高壓熱水浸提牛至，提高環(huán)糊精濃度能增加牛至中香芹酚含量和浸出液抗氧化性能，浸提溫度和時(shí)間對(duì)浸提液抗氧化活性具有雙重作用。最佳的高壓熱水浸提工藝：環(huán)糊精濃度為1%、浸提溫度為112 ℃、浸提時(shí)間為20 min。本工藝增加了牛至中抗氧化物質(zhì)的溶出，為牛至產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供了新的途徑。