李亞倬，黃亞麗，于紅紅，王靜云，盧士玲

（石河子大學食品學院，新疆 石河子 832000）

酪胺是以酪氨酸為前體物質(zhì)經(jīng)脫羧后形成的一種血管活性生物胺（圖1），廣泛存在于奶酪、豆制品和發(fā)酵肉制品等食品中[1]。當體內(nèi)酪胺含量過高或分解代謝受阻時，過量的酪胺進入血液，刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，過度釋放去甲腎上腺素，使大腦和心臟處于高壓狀態(tài)從而引發(fā)一系列的生理反應(yīng)，包括頭痛、偏頭痛、發(fā)熱、心悸、流涎、流淚等[2]。嚴重時甚至導致醫(yī)療并發(fā)癥：心跳過快，外周血管收縮，心臟輸血量增加，血壓上升引發(fā)高血壓。這可能對患有冠狀動脈疾病或VB12缺乏的患者造成生命威脅[3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定，魚類中酪胺含量不得超過100 mg/kg[4]?？傊?，減少食物中酪胺的產(chǎn)生以避免酪胺的過量攝入至關(guān)重要。

圖1 酪氨酸脫羧生成酪胺示意圖Fig. 1 Decarboxylation of tyrosine into tyramine

研究學者已對不同微生物編碼酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylase，TDC）途徑的基因簇進行了充分研究。例如，腸球菌屬[5-6]、短乳桿菌[7-8]、彎曲乳桿菌[9]、清酒乳桿菌[10]中均被證實酪氨酸脫羧酶基因主要由4 種基因組成，分別為編碼酪氨酸脫羧酶的tyr DC[11]、編碼酪氨酸/酪胺透性酶的tyr P、編碼酪氨酰-tRNA合成酶的tyr S以及編碼Na＋/H＋轉(zhuǎn)運蛋白的nha C[12-15]。

雪菊（Coreopsis tinctoria）主要分布在新疆昆侖山，是一種可與雪蓮相媲美的高山野生植物，具有抑菌、抗氧化、保護臟器、降糖、降脂、抗炎和抗癌等多種生理作用，有較高的藥用價值[16-17]。雪菊精油的主要成分為D-檸檬烯（含量約50%～70%）和黃酮類化合物（總黃酮含量約15%～25%）[18-20]。雪菊精油具有較強的抗菌、抗氧化作用[21]，是一種天然抗菌劑，對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、白色葡萄球菌、新生隱球菌和金黃色葡萄球菌的生長有很強的抑制作用[22-23]。但對于雪菊精油是否對微生物產(chǎn)酪胺有抑制作用，以及是否影響TDC途徑中相關(guān)基因表達還有待研究。本實驗以高產(chǎn)酪胺的希氏腸球菌（Enterococcus hirae）為研究對象，探討在純菌體系和熏馬腸中雪菊精油對希氏腸球菌抑菌能力、TDC途徑中TDC基因簇相關(guān)基因表達水平和產(chǎn)酪胺量的影響，為雪菊精油在食品領(lǐng)域的應(yīng)用開辟新的思路，同時為熏馬腸中酪胺含量的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌：希氏腸球菌N47，GenBank登錄號為MT729969，從新疆熏馬腸中分離保存，該工作在石河子大學食品學院完成。

馬肉、天然動物腸衣 新疆伊犁市伊卡孜有限公司；食鹽 福建泉州晶海輕化有限公司；味精、香料粉華星龍盛（廈門）食品有限公司；亞硝酸鈉配料 四川金山制藥有限公司；煙熏液 濟南市歷城區(qū)金牛山食品香料廠。

天山雪菊精油（100%純單方） 霍城縣五彩河谷農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司；吐溫80（化學純）、環(huán)糊精（純度≥99%） 天津福晨化學試劑廠；丹磺酰氯、酪胺標準品、L-酪氨酸、磷酸吡哆醛、乙腈（色譜純） 美國Sigma公司；BHI培養(yǎng)基 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Trizol試劑（MagZolTMReagent）美國Invitrogen公司；5×All-In-One RT Master Mix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit) cDNA合成試劑盒、EvaGreen 2×qPCR MasterMix low ROX 加拿大Applied Biological Materials公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ND2000C微量核酸測定儀 香港基因有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；UB-7型pH計 德國賽多利斯公司；5417R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；高速冷凍離心機美國貝克曼公司；多功能酶標儀 美國Bio-Tek儀器有限公司；M×3000P型實時聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國安捷倫科技公司；ACQUITY Arc System高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Waters公司；T25 DS 25型勻漿機 德國IKA公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司；9020-0094 KBF 240型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 德國Binder公司。

1.3 方法

1.3.1 雪菊精油抑菌能力的測定

取在－18 ℃斜面保藏的希氏腸球菌N47接種在BHI液體培養(yǎng)液（pH 5.5）中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，振蕩菌液，使用滅菌金屬接種環(huán)蘸取菌液劃線于固體BHI平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取平板上單一菌落再次接種至BHI液體培養(yǎng)基中，完成3 次活化。使用0.85 g/100 mL無菌生理鹽水稀釋菌懸液至濃度為104～105CFU/mL，即菌懸液在600 nm處光密度約為0.3。參照于紅紅等[24]的方法采用雙倍稀釋法測定雪菊精油對供試菌最低殺菌濃度（minimal bactericidal concentration，MBC）和最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.3.2 希氏腸球菌純培養(yǎng)

準備5 個150 mL錐形瓶，分別加入含體積分數(shù)0.005%磷酸吡哆醛的BHI液體培養(yǎng)基100 mL。分為4 組：第1組僅添加體積分數(shù)0.5%酪氨酸（L）；第2組添加0.5%酪氨酸和1/2 MIC雪菊精油（1/2M）；第3組添加0.5%酪氨酸和MIC雪菊精油（M）；第4組為空白組，不添加酪氨酸和雪菊精油（K）。用不添加供試菌的陰性組作對照。雪菊精油用體積分數(shù)10%的吐溫-80溶解：先將精油與吐溫-80充分混勻，再邊攪拌邊加入蒸餾水。供試菌均按體積分數(shù)4%接種，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。

1.3.3 雪菊精油對供試菌生長過程中pH值和OD600nm的影響

每隔4 h，用pH計測定1.3.2節(jié)所述4 組菌懸液pH值，用多功能酶標儀在波長600 nm處測定OD600nm，繪制希氏腸球菌在BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的生長曲線。

1.3.4 real-time PCR測定菌懸液TDC基因簇相關(guān)基因表達量

1.3.4.1 RNA的提取

為獲得高質(zhì)量的cDNA模板提取樣本RNA，以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1.3.2節(jié)生長至穩(wěn)定期（24 h）的菌液2.0 mL，于4 ℃、1 000×g離心5 min，棄上清液；重復(fù)上述步驟3 次。采用Trizol法提取細菌總RNA，注意操作過程在冰上完成。根據(jù)MagZolTMReagent說明將所提RNA渦旋后，用無酶水校準微量核酸測定儀，吸取1 μL RNA樣品于加樣板，測定A260nm/A280nm、A260nm/A230nm和RNA濃度，檢測RNA純度。當A260nm/A280nm為1.9～2.1、A260nm/A230nm為1.8～2.5時，表明所提RNA純度較高。取1 μL RNA上樣于1%瓊脂糖凝膠，5 V/cm電泳30 min。當凝膠電泳在28S、18S和5S處有清晰條帶時，認為所提RNA具有良好的完整性。待RNA純度以及完整性達到要求后，進行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4.2 cDNA的合成

為避免基因組DNA（gDNA）污染影響后續(xù)反轉(zhuǎn)錄實驗，在合成cDNA前對RNA進行g(shù)DNA去除。按照cDNA合成試劑盒，2 μg RNA模板加入2 μL AccuRT Reaction Mix（4×），無酶水加至終體積為8 μL，室溫下孵育5 min，然后加入2 μL AccuRT Reaction Stopper（5×），反應(yīng)試劑充分混勻，以去除gDNA。然后加入4 μL 5×All-In-One RT MasterMix、6 μL無酶水，25 ℃孵育10 min，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育10 min終止反應(yīng)，于冰上冷卻，合成cDNA。合成的cDNA產(chǎn)物在－20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，作為下游的real-time PCR反應(yīng)模板。所有反應(yīng)在無酶環(huán)境中進行，并且始終將RNA置于冰上，防止RNA模板降解。

1.3.4.3 real-time PCR定量基因表達

按照EvaGreen 2×qPCR MasterMix試劑盒說明書步驟操作，real-time PCR反應(yīng)體系（20 μL）：模板cDNA 2 μL、EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10.0 μL、上下游引物各0.6 μL、無酶水6.8 μL。引物見表1。real-time PCR試劑加入無酶八連管中，離心使反應(yīng)液充分混勻后，立即進行real-time PCR。每組3 個平行。TDC基因簇基因相對表達量按2－ΔΔCt計算[25]。其中，ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因；ΔΔCt=ΔCt處理組－ΔCt空白組。Tyr DC、tyr P、tyr S以及nha C均以recA和tuf為內(nèi)參基因，取均值。

表1real-time PCR所用引物Table 1 Primers used for real-time PCR

1.3.5 菌懸液中酪胺含量的測定

用0.4 mol/L高氯酸溶解10 mg酪胺標準品，并于5 mL棕色容量瓶中定容，分別稀釋成終質(zhì)量濃度為5、10、15、25、50、100、200 μg/mL的標準溶液。取1.3.2節(jié)供試菌液，培養(yǎng)48 h期間每隔4 h取樣，12 000×g離心10 min，吸取1 mL上清液，加入相同體積0.4 mol/L高氯酸溶液，混勻，作為菌液樣品處理液。

酪胺結(jié)構(gòu)中缺少紫外檢測器可檢測到的發(fā)光基團，因此將酪胺提取液和衍生化試劑（丹磺酰氯）進行衍生化反應(yīng)。取酪胺標準溶液與菌液樣品處理液各1 mL，置于7 mL棕色樣品瓶中，加入200 μL 2 mol/L NaOH溶液使溶液呈堿性，再加入300 μL飽和NaHCO3溶液進行緩沖，然后再加入2 mL 10 mg/mL 丹磺酰氯溶液（丙酮配制），振蕩搖勻15 s，于40 ℃暗反應(yīng)45 min后加入100 μL氨水，靜置30 min，終止反應(yīng)。用乙腈添加至終體積為5 mL，用0.22 μm濾膜過濾，待HPLC檢測。

HPLC條件：色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為超純水，B為乙腈；流速0.8 mL/min；進樣量5 μL；紫外檢測波長254 nm；柱溫30 ℃[29]。梯度洗脫程序為：0～5 min，35% A、65% B；5～24 min，0% A、100% B；24～25 min，35% A、65% B；25～30 min，B 65%。酪胺標準溶液不同質(zhì)量濃度（x）與對應(yīng)峰面積（y）作標準曲線，方程為y=2 945x＋2 398.9（R2=0.999 8）。根據(jù)回歸方程計算菌液中的酪胺含量。

1.3.6 熏馬腸的制備

按照Lu Shiling等[30]所述工藝制備4 組熏馬腸：A組（不添加雪菊精油、不接種產(chǎn)胺菌）、B組（接種希氏腸球菌、不添加雪菊精油）、C組（接種希氏腸球菌、添加1/2 MIC雪菊精油）、D組（接種希氏腸球菌、添加MIC雪菊精油）。希氏腸球菌N47接種量均約為103CFU/mL。

原料馬肉用絞肉機切成小塊，按照瘦肉、肥肉質(zhì)量比80∶20混合，向肉糜中添加輔料（2.5%食鹽、0.1%味精、0.1%香料粉、2%白糖、0.005%亞硝酸鈉配料和1%煙熏液，均為質(zhì)量分數(shù)）腌制。按照分組添加（或不添加）不同質(zhì)量濃度雪菊精油，以及接種（或不接種）希氏腸球菌。然后采用灌裝機將不同處理組的混合肉糜灌入天然腸衣制成香腸。香腸在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中成熟程序進行發(fā)酵。

1.3.7 熏馬腸pH值、細菌計數(shù)和酪胺含量的測定

在熏馬腸發(fā)酵第0、2、7、14、21、28天分別采樣進行測定。

稱取5 g剪碎熏馬腸肉糜，在90 mL蒸餾水中拍打6 min，在室溫下用數(shù)字pH計測定pH值。

參考Sun Qinxiu[31]和Laranjo[32]等描述的平板計數(shù)法，測定熏馬腸發(fā)酵過程中總需氧菌（total aerobic bacteria，TAB）、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）和腸細菌總數(shù)。

按照Lu Shiling等[30]的方法進行樣品前處理，將5 g熏馬腸樣品在20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液中均質(zhì)，提取液4 ℃、5 000×g離心10 min，重復(fù)上述步驟。收集25 mL上清液，并用0.4 mol/L高氯酸溶液添加至50 mL得到樣品溶液。按照1.3.5節(jié)進行衍生化反應(yīng)及酪胺含量HPLC定量測定。每組樣品做3 個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 雪菊精油對希氏腸球菌N47的抑菌能力

雪菊精油對希氏腸球菌N47具有抑制作用，MIC和MBC分別為0.39 mg/mL和0.78 mg/mL。張艷梅等[23]探討了昆侖雪菊揮發(fā)油對新生隱球菌抗菌能力，發(fā)現(xiàn)昆侖雪菊揮發(fā)油能夠破壞新生隱球菌細胞膜達到抑菌效果，其對新生隱球菌的MIC為0.781 μL/mL。這一結(jié)果與本研究一致，均證明了雪菊精油的抑菌能力，但是本研究中雪菊精油對希氏腸球菌的MIC較低，這可能是由于菌體結(jié)構(gòu)不同，導致希氏腸球菌對雪菊精油更為敏感。此外，迪里努爾·阿布都熱合曼等[33]用體積分數(shù)95%乙醇溶液將雪菊樹脂精油稀釋至不同體積分數(shù)（1.563%～75%），用濾紙片法對雪菊樹脂精油的抑菌能力進行測定，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌、枯草桿菌、青霉和黑曲霉的MIC分別為體積分數(shù)25%、50%、75%、50%和75%。

2.2 雪菊精油對希氏腸球菌N47生長的影響

圖2 雪菊精油對希氏腸球菌N47生長過程中OD600 nm的影響Fig. 2 Effect of C. tinctoria essential oil on OD600 nm during the growth of E. hirae N47

菌懸液OD600nm越大，表明細菌數(shù)量越多。如圖2所示，添加雪菊精油的細菌OD600nm始終低于不添加雪菊精油組，說明雪菊精油能夠抑制希氏腸球菌N47的生長，且雪菊精油添加量越大，其抑制作用越強。但是雪菊精油并沒有改變其生長趨勢，只是其生長周期相對延長。1/2 M和M組中，希氏腸球菌N47分別在培養(yǎng)28 h和32 h進入穩(wěn)定期，生長量相對同一時間酪氨酸組（L組）分別下降了67.09%和75.43%。有研究發(fā)現(xiàn)，雪菊中的抑菌成分以黃酮類化合物為主，特別是多羥基結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物[34-35]?？岛炅岬萚22]通過微波輔助法提取昆侖雪菊中的總黃酮，測定雪菊總黃酮對細菌、霉菌及酵母菌的抑菌性能，發(fā)現(xiàn)雪菊總黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、曲霉、酵母菌以及青霉的MIC分別為0.625、0.3125、0.3125、2.5、2.5、5.0 mg/mL。張艷梅等[23]對昆侖雪菊精油進行氣相色譜-質(zhì)譜分析，鑒定其主要抗菌組分是D-檸檬烯和α-蒎烯。這些抑菌成分會嚴重破壞新生隱球菌細胞膜，使核酸以及相關(guān)合成物質(zhì)泄漏，削弱細胞活力，最終導致新生隱球菌死亡。此外，還有研究指出天然植物精油還可以通過影響微生物代謝相關(guān)基因的表達，致使菌體衰亡[36]。

2.3 雪菊精油對希氏腸球菌N47生長過程中pH值的影響

如圖3所示，所有組pH值均在前16 h內(nèi)呈上升趨勢。這是由于產(chǎn)胺菌在對數(shù)期快速繁殖，酪氨酸在酪氨酸脫羧酶作用下形成酪胺，而呈堿性酪胺的大量產(chǎn)生使培養(yǎng)液pH值快速上升。這一結(jié)果和薛林林等[29]對糞腸球菌和屎腸球菌的研究結(jié)果不一致，可能是由于希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺能力更強，其產(chǎn)酪胺的速率遠大于產(chǎn)有機酸的速率。Fernandez等[37]的研究結(jié)果也表明在氨基酸存在的情況下，產(chǎn)生物胺的細菌能夠引起培養(yǎng)基pH值增加。1/2M、M組的最終pH值與L組相比均顯著降低（P＜0.05），說明雪菊精油可以有效降低培養(yǎng)基pH值，從而抑制希氏腸球菌N47的生長。Wang Yongli等[38]發(fā)現(xiàn)綠茶精油和葡萄籽精油可以顯著降低干腌臘肉的pH值。

圖3 雪菊精油對希氏腸球菌N47生長過程中pH值的影響Fig. 3 Effect of C. tinctoria essential oil on pH during the growth of E. hirae N47

2.4 雪菊精油對希氏腸球菌N47 TDC基因表達的影響

圖4 雪菊精油對希氏腸球菌N47 TDC相關(guān)基因表達量影響Fig. 4 Effect of C. tinctoria essential oil on the relative gene expression of tyrosine decarboxylase in E. hirae N47

如圖4所示，相比空白組（K），添加酪氨酸（L）的希氏腸球菌N47中tyr DC、tyr P基因表達量均顯著上調(diào)（P＜0.05），分別是K組的403.10 倍和795.11 倍。tyr DC和tyr P這兩種基因的上調(diào)，是由于向反應(yīng)體系中添加酪氨酸，為酪氨酸脫羧酶和酪氨酸/酪胺滲透酶提供了足夠的前體物質(zhì)。在酸性環(huán)境中，希氏腸球菌N47通過氨基酸脫羧反應(yīng)產(chǎn)生堿性物質(zhì)抵抗胞外的酸性環(huán)境。大量研究證明，氨基酸脫羧酶基因的表達需要酸性環(huán)境和高濃度的氨基酸底物[37]。在酪氨酸存在的情況下，添加MIC雪菊精油（M）的tyr DC和tyr P基因的表達量相比酪氨酸組（L）分別顯著降低了99.45%和95.18%（P＜0.05）。有研究表明在酪胺形成機制中主要參與的基因是tyr DC和tyr P，這進一步表明雪菊精油可以通過影響酪氨酸脫羧酶和轉(zhuǎn)運酪胺/酪氨酸蛋白的活性，減少相關(guān)基因表達量以及酪胺的積累[11]。這一結(jié)果和薛林林等[29]的研究結(jié)果一致，其發(fā)現(xiàn)阿魏酸可以顯著抑制屎腸球菌和糞腸球菌中tyr DC、tyr P基因的表達，從而減少酪胺的產(chǎn)生[29]。

酪氨酸組（L）tyr S基因的表達顯著低于不添加酪氨酸的K組（P＜0.05）。Linares等[39]得出類似結(jié)果，其研究顯示杜蘭氏腸球菌在酸性條件下，未添加酪氨酸時tyr S表達量最高，比酪氨酸誘導的mRNA表達水平高10 倍以上。酪氨酰-tRNA合成酶基因在酪氨酸不充足的條件下被激活，以防止這種氨基酸的大規(guī)模脫羧，確保其可用于蛋白質(zhì)合成[39]。與酪氨酸組（L）相比，添加雪菊精油的希氏腸球菌N47中tyr S基因上調(diào)。這可能是由于精油組中希氏腸球菌N47的生長代謝受到抑制，生物活性減弱，使之利用培養(yǎng)基中酪氨酸能力降低，引發(fā)細胞的TDC基因簇遺傳調(diào)控的負反饋調(diào)節(jié)機制[29]，觸發(fā)tyr S基因轉(zhuǎn)錄，誘導酪氨酸合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)維持自身的正常的生命活動。

相比L組，雪菊精油顯著降低nha C基因的表達（P＜0.05），M組nha C基因表達量僅為酪氨酸組（L）的65.29%。關(guān)于產(chǎn)胺菌nha C基因在酪胺合成中的確切功能尚不明確，但可以確定雪菊精油能夠抑制Na＋/H＋轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達。

2.5 雪菊精油對希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺含量的影響

圖5 雪菊精油對希氏腸球菌培養(yǎng)48 h酪胺積累的影響Fig. 5 Effect of C. tinctoria essential oil on the accumulation of tyramine in E. hirae during 48 h cultivation

如圖5所示，在僅添加酪氨酸情況下（L），希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺含量的變化趨勢與其生長趨勢一致。該菌在前12 h酪胺含量急劇增加，隨后酪胺積累速度減慢，在24 h后含量逐漸趨于穩(wěn)定，最終酪胺生成量最高達到189.84 μg/mL。顯然，在酪氨酸含量充足的情況下，酪胺積累量和菌數(shù)呈正相關(guān)，添加酪氨酸可顯著提高供試菌產(chǎn)酪胺量。由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)有限，空白組（K）的酪胺終產(chǎn)量相對偏低。這說明希氏腸球菌N47產(chǎn)酪胺量依賴于外界環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)總量。蛋白質(zhì)豐富的食品更易出現(xiàn)生物胺超標這一食品安全問題。

不同質(zhì)量濃度的雪菊精油對減少供試菌的酪胺產(chǎn)生量具有顯著效果（P＜0.05），在添加1/2 MIC、MIC雪菊精油時，希氏腸球菌N47中培養(yǎng)48 h的酪胺最終生成量分別為35.62 μg/mL和17.84 μg/mL，較酪胺組（L）分別減少了81.24%和90.60%。這表明雪菊精油質(zhì)量濃度越大，其酪胺積累量越低。結(jié)合2.2節(jié)和2.4節(jié)結(jié)果，雪菊精油不僅從源頭抑制產(chǎn)胺菌的生長，還通過顯著降低存活菌tyr DC、tyr P表達量，從細菌數(shù)量和基因表達上雙重阻礙了酪胺的積累。大量研究表明，天然植物提取物能夠抑制食品中生物胺的形成。Erol等[40]研究石榴籽提取物對谷物發(fā)酵食品Tarhana中生物胺形成的影響，發(fā)現(xiàn)添加0%、0.5%、1%、2%石榴籽提取物后，Tarhana中總生物胺含量分別為894.7、569.67、514.52、424.60 mg/kg。Martín等[41]研究百里香精油和牛至精油對真空包裝鯉魚魚片中生物胺形成的影響，證實了這兩種精油均能顯著抑制腐胺、尸胺、酪胺和苯乙胺在魚片中的積累。

2.6 雪菊精油對熏馬腸發(fā)酵過程中pH值的影響

圖6 雪菊精油對新疆熏馬香腸發(fā)酵過程中pH值的影響Fig. 6 Effect of C. tinctoria essential oil on pH of Xinjiang smoked horse sausage during fermentation

如圖6所示，所有香腸的pH值均在前7 d呈下降趨勢，這是由于熏馬腸中乳酸菌在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生有機酸，使得熏馬腸的pH值降低[42]。發(fā)酵7～28 d，pH值緩慢上升，這可能是由于堿性化合物的積累，如胺、肽和氨基酸[43]。在發(fā)酵后期（21～28 d），添加1/2 MIC（C）和MIC雪菊精油（D）的熏馬腸pH值均顯著低于對照組（B）（P＜0.05）。大量研究發(fā)現(xiàn)，添加植物提取物，如蔥[44]、栗子、綠茶、葡萄、海藻[45]和石榴籽[40]的提取物可有效降低發(fā)酵食品pH值。pH值的降低對于提高發(fā)酵肉制品所需顏色的轉(zhuǎn)化率、抑制有害細菌的生長以及減少發(fā)酵肉制品中不良風味的形成至關(guān)重要[38]。

2.7 熏馬腸發(fā)酵過程中微生物菌落總數(shù)變化

表2 雪菊精油對新疆熏馬腸發(fā)酵過程中TAB、LAB和腸細菌數(shù)量的影響Table 2 Effect of C. tinctoria essential oil on total aerobic bacterial count, lactic acid bacterial count, and Enterobacteriaceae count in Xinjiang smoked horse sausages during fermentation lg（CFU/g）

如表2所示，在整個發(fā)酵過程中，A、B、C和D組總TAB總數(shù)均呈先上升后下降的趨勢，A、C和D組均在發(fā)酵第7天達到最大值，第28天分別降至6.77、7.59、6.17、5.82（lg（CFU/g））?？梢?，雪菊精油對熏馬腸中細菌的生長有顯著抑制作用（P＜0.05）[38]。Sun Qinxiu等[46]發(fā)現(xiàn)添加香料提取物（肉桂、茴香和丁香）的哈爾濱干香腸中需氧細菌總數(shù)較低（P＜0.05）。

在熏馬腸整個發(fā)酵過程中，乳酸菌的變化趨勢與TAB類似。LAB在發(fā)酵初期急劇增加，成為主要微生物，不僅促進了風味物質(zhì)的形成，而且加速了熏香腸體系pH值的下降。LAB在發(fā)酵后期數(shù)量減少，這可能是由于熏馬腸中低水分含量、低pH值以及代謝產(chǎn)物積累等不利條件。在發(fā)酵結(jié)束時，B、C、D組熏馬腸中乳酸菌含量無顯著差異（P＞0.05），這表明雪菊精油對LAB的抑制作用不強。這與Yu Honghong的研究結(jié)果類似[47]。

與對照組（B）相比，C組和D組熏馬腸中的腸細菌數(shù)量均顯著減少（P＜0.05），說明雪菊精油對腸細菌有較強的抑制作用，這與Sun Qinxiu等[46]報道的結(jié)果一致。再次證明植物精油可以作為合成抑菌劑的替代品添加至傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中，以提高食品的安全性。

2.8 熏馬腸發(fā)酵過程中的酪胺積累量分析

圖7 雪菊精油對新疆熏馬腸發(fā)酵過程中酪胺積累的影響Fig. 7 Effect of C. tinctoria essential oil on tyramine accumulation in Xinjiang smoked horse sausage during fermentation

如圖7所示，未添加雪菊精油的熏馬腸樣品中酪胺含量在前14 d均顯著上升（P＜0.05），這與香腸中產(chǎn)酪胺菌的快速增殖有關(guān)；發(fā)酵第14～28天緩慢上升可能是由于香腸pH值和水分含量降低，不利于微生物的生長。對照組（B）、1/2 MIC（C）和MIC雪菊精油組（D）的初始酪胺含量均值為2.07 mg/kg，在第28天時酪胺含量分別增加到222.57、78.52 mg/kg和45.83 mg/kg。第28天時1/2 MIC組和MIC組熏馬腸中酪胺含量分別較對照組（B）降低了64.72%和79.41%，表明雪菊精油能夠顯著抑制熏馬腸中酪胺的積累，且雪菊精油質(zhì)量濃度越大抑制能力越強（P＜0.05）。與此結(jié)果一致，Cai Luyun等[48]發(fā)現(xiàn)添加丁香、孜然和留蘭香精油可以有效抑制發(fā)酵鳳尾魚中生物胺的積累。

3 結(jié) 論

在純菌培養(yǎng)體系中，雪菊精油能夠顯著抑制希氏腸球菌的生長并降低培養(yǎng)液pH值，且雪菊精油質(zhì)量濃度越高，作用越強。雪菊精油能顯著抑制TDC基因簇中tyr DC、tyr P基因的表達（P＜0.05），從而抑制TDC途徑，降低酪胺積累量。雪菊精油通過抑制希氏腸球菌的生長和tyr DC、tyr P的表達，雙重阻礙酪胺的積累。當添加MIC雪菊精油時，希氏腸球菌N47的酪胺生成量較酪氨酸組（L）減少了90.60%。在熏馬腸體系中，添加雪菊精油抑制了不良腸細菌的滋生，降低了產(chǎn)品pH值，降低了酪胺積累量。1/2 MIC和MIC雪菊精油組熏馬腸相比于對照組（B）酪胺積累量分別減少了64.72%和79.41%?？傊?，雪菊精油能有效抑制酪胺的形成，提高新疆熏馬腸的產(chǎn)品安全性。