范婷婷，趙曉燕，李曉貝，張艷梅，李健英，周昌艷

（上海市農業(yè)科學院農產品質量標準與檢測技術研究所，農業(yè)農村部食用菌產品質量監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海 201403）

羊肚菌（Morchella esculenta）是一種珍稀名貴的食、藥兩用真菌，由于其菌蓋表面有不規(guī)則多面凹陷皺褶，狀如羊肚，故名羊肚菌[1]。羊肚菌風味獨特、味道鮮美且營養(yǎng)豐富，富含多糖、呈味氨基酸、微量元素、黃酮類等功能成分，具有抗氧化[2-3]、調節(jié)機體免疫力[4-5]、抗腫瘤[6]、緩解應急性疲勞[7-8]等功效，在保健品開發(fā)方面具有廣闊的應用前景。

近年來，培育技術的不斷突破基本實現(xiàn)了羊肚菌的大面積室外栽培和商業(yè)化生產，一定程度上緩解了因產量低、采集困難而導致的野生羊肚菌市場價格昂貴的現(xiàn)狀。隨著羊肚菌產量的突破，其滋味品質成為關注重點。游離氨基酸（free amino acids，F(xiàn)AAs）占總氨基酸的25%～35%，是一類重要的味覺活性成分，各種FAAs都有其獨特的滋味，如鮮味、甜味、苦味及無味等，其含量會直接影響食物的鮮美程度[9-10]。FAAs中谷氨酸是重要的鮮味氨基酸，對羊肚菌的呈鮮作用貢獻較大[11]。劉興勇等[12]僅對云南省羊肚菌的FAAs含量進行測定，發(fā)現(xiàn)云南省不同產地間的人工栽培羊肚菌FAAs含量無顯著差異，野生較人工栽培羊肚菌鮮味突出。

主成分分析（principal component analysis，PCA）是用較少的變量反映原始數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計方法[13]。目前PCA已廣泛用于食用菌品質的綜合評價，Sun Liping等[14]通過PCA對13 種野生食用菌FAAs進行綜合評價，發(fā)現(xiàn)野生食用菌特征性FAAs的含量高低對食用菌的風味具有直接的影響。Dong Meng等[15]采用PCA發(fā)現(xiàn)10 個不同產地、季節(jié)和品種的干香菇中FAAs和5′-核苷酸的含量存在顯著差異，這為香菇品種和產地的快速鑒別和質量評估提供參考。段靜怡等[16]通過PCA達到了對4 種食用菌和4 種果蔬的顯著區(qū)分和快速鑒別。

目前羊肚菌在我國云南、四川、甘肅、河南、吉林、遼寧等多地實現(xiàn)人工栽培，但受不同海拔、溫濕度、光照、土壤環(huán)境和外源營養(yǎng)等因素影響，常表現(xiàn)為地域差異大，出菇穩(wěn)定性差、產量低等特點[17-18]，而這些環(huán)境因素對羊肚菌滋味成分也會產生影響[19]。本實驗擬通過對云南、四川、吉林、甘肅的人工栽培和野生羊肚菌FAAs組成及含量進行分析，并對呈味氨基酸的滋味活性值（taste active value，TAV）進行比較，采用PCA法和聚類分析法進行綜合評價，旨在為人工栽培和野生羊肚菌的地域間差異、營養(yǎng)價值及滋味比對提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人工栽培羊肚菌每個省份3 份，共12 份，均為黑羊肚菌支系的六妹羊肚菌（Morchella sextelata），由各省份的野生羊肚菌培育馴化后栽培，樣品信息見表1。野生羊肚菌每個省份3 份，共12 份，樣品信息見表2。

氨基酸混合標準溶液、茚三酮顯色液（均為色譜純）日本W(wǎng)ako公司；氨基酸自動分析儀所用緩沖液（色譜純） 日本Mitsubishi公司；鹽酸、氫氧化鈉（均為優(yōu)級純） 國藥集團化學試劑有限公司；磺基水楊酸（優(yōu)級純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

表2 不同省份野生羊肚菌樣品信息Table 2 Sample information of wild Morchella collected from different provinces

1.2 儀器與設備

L-8900氨基酸自動分析儀 日本Hitachi公司；N-EVAP112氮吹儀 美國Organomation公司；5424R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；YCQ-300超聲波清洗機 上海凱波超聲設備有限公司；AL204-IC電子天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FD5-3T凍干機金西盟（北京）儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 FAAs含量測定

羊肚菌在－50 ℃冷凍干燥24 h，凍干后打成粉末，密封保存。準確稱取樣品0.3 g（精確至0.000 1 g），加入30 mL 0.1 mol/L鹽酸溶液（優(yōu)級純），40 ℃超聲30 min，冷卻至室溫后于10 000 r/min離心5 min。取上清液1 mL，以1∶1的比例加入5%磺基水楊酸溶液混合，混合液4 ℃放置30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min。取上清液加1 滴10 mol/L氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至2.0左右，過0.22 μm水系微孔濾膜，由氨基酸自動分析儀測定FAAs含量。

1.3.2 儀器檢測條件

采用離子交換色譜-茚三酮柱后衍生法測定樣品中FAAs。陽離子交換柱（4.6 mm×60 mm）；柱溫57 ℃，檢測器溫度135 ℃；緩沖溶液流速0.40 mL/min，茚三酮流速0.35 mL/min；檢測波長：第1通道波長570 nm，測定17 種氨基酸，第2通道波長440 nm，測定脯氨酸；進樣量20 μL，每個樣品分析時間約30 min。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel 2016軟件計算FAAs數(shù)據(jù)的平均值、標準差及雷達圖。采用SPSS Statistics 19軟件通過單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）進行顯著性分析，分析方法為Duncan多重范圍檢驗，P＜0.05，差異顯著。

1.4.2 TAV分析

TAV是樣品中呈味物質的測定值與其滋味閾值之比，按下式計算[20]：

式中：ρ1為呈味氨基酸含量/（mg/g）；ρ2為該氨基酸滋味閾值/（mg/g）。

TAV可反映單一化合物對整體滋味的貢獻，當TAV＞1時，認為該物質對呈味有貢獻，而TAV＜1時，認為該物質對呈味貢獻較小，由此確定羊肚菌主要的呈味氨基酸[21]。

1.4.3 適應性檢驗

采用SPSS Statistics 19軟件中Pearson分析法進行相關系數(shù)矩陣直接檢驗，根據(jù)相關系數(shù)矩陣中相關系數(shù)反映的原始變量之間的線性相關程度進行適用性檢驗。

1.4.4 PCA及綜合評價

采用SIMCA 13.0軟件進行PCA，比較不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs的差異，得到原始數(shù)據(jù)相關系數(shù)矩陣的特征值、方差貢獻率、成分矩陣及成分得分系數(shù)矩陣等，抽取特征值大于1.00的因子作為PC。利用PC信息對不同省份人工栽培和野生羊肚菌進行綜合評價，以每個PC對應特征值的方差貢獻率βi（i=1,2,…,k）為權數(shù)，乘以各PC得分Fi，加和得到綜合評價模型：F=β1F1＋β2F2＋…＋βkFk[22-23]。

1.4.5 聚類分析

根據(jù)8 類不同省份人工栽培和野生羊肚菌中FAAs組成及含量測定結果，采用SPSS Statistics 19軟件進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 人工栽培和野生羊肚菌FAAs含量差異

對于人工栽培羊肚菌，云南和四川的出菇時間為2—4月，以大田輪作的方式種植玉米、水稻等經(jīng)濟作物，而吉林和甘肅的出菇時間稍晚，為4—5月，以大棚獨立栽培為主。野生羊肚菌的生長期受氣候條件影響，與其生長地區(qū)降雨時間的早晚、降雨量和氣溫密切相關，一般在高濕、低溫條件下易萌發(fā)子實體，因此野生羊肚菌子實體的生長季節(jié)一般在每年3—6月[24]。

本實驗對來自云南、四川、吉林和甘肅的人工栽培和野生羊肚菌FAAs組成及含量進行比較，野生羊肚菌檢測到18 種FAAs，但人工栽培羊肚菌中Trp和Pro未檢出，結果見表3。由表3可知，人工栽培和野生羊肚菌在不同氨基酸存在差異，野生羊肚菌中Met、Phe、Asp、Glu、Tyr、His的含量均大于人工栽培羊肚菌，只有Lys、Arg的含量均小于人工栽培羊肚菌。來自不同省份的人工栽培羊肚菌FAAs總量差異較大，吉林省的含量最高，為43.07 mg/g，四川省的含量最低，為20.77 mg/g。同省份間野生羊肚菌FAAs總量差異相對小，在29.04～35.48 mg/g之間，其中甘肅省的含量最高，吉林省的含量最低。同一省份人工栽培和野生羊肚菌進行對比，吉林省羊肚菌FAAs總量相差最大，且人工栽培＞野生，其余省均為野生大于人工栽培。相關研究表明，栽培料配方、土壤環(huán)境等因素對羊肚菌品質影響較大[25-27]，但是否引起人工栽培和野生羊肚菌氨基酸差異的主要因素有待進一步研究。

2.2 人工栽培和野生羊肚菌FAAs滋味評價

FAAs是食品中的主要呈味基礎物質之一，根據(jù)FAAs滋味特征，可將其分為鮮味氨基酸（Glu、Asp、Lys）、甜味氨基酸（Ala、Thr、Ser、Gly、Pro、His）、苦味氨基酸（Arg、Val、Met、Ile、Leu、Trp）和芳香族氨基酸（Phe、Tyr、Cys）四大類[28]。食用菌的鮮美滋味是由不同呈味FAAs之間的平衡及相互影響決定，對食用菌風味具有重要作用。

表3 不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs組成及含量比較Table 3 Comparison of composition and content of free amino acids between cultivated and wild Morchella from different provinces mg/g

對來自云南、四川、吉林和甘肅的人工栽培和野生羊肚菌FAAs的TAV進行評價，結果見表4，并通過雷達圖對呈味FAAs的含量進行比對，見圖1。從呈味氨基酸比較看，甜味氨基酸和苦味氨基酸含量較高，鮮味氨基酸其次，芳香族氨基酸最少。吉林人工栽培羊肚菌的甜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香族氨基酸的總含量均最高，云南野生羊肚菌的鮮味氨基酸含量最高。由表4和圖1可知，野生羊肚菌的鮮味氨基酸TAV顯著高于人工栽培羊肚菌，其中Glu的TAV最高，野生羊肚菌TAV在13.75～17.79之間，人工栽培羊肚菌TAV在5.28～11.02之間。Yamaguchi等[30]研究發(fā)現(xiàn)Glu和Asp是鮮味的基本組成成分，Glu的鮮味最強，呈味閾值為0.3 mg/mL，它是味精中的主要成分，能呈現(xiàn)出較強的鮮味。甜味氨基酸中除了吉林省，其余省份的野生羊肚菌的甜味氨基酸總含量都大于人工栽培羊肚菌，其中Ala的TAV最高且在人工栽培和野生羊肚菌之間差別較大。甜味氨基酸不僅能掩蓋苦澀味，同時能與鮮味氨基酸協(xié)同作用，起到增香增鮮的效果[31]?？辔栋被嶂蠥rg的TAV最高，其呈味作用均為野生小于人工栽培。芳香族氨基酸中Phe和Tyr的呈味作用均為野生大于人工栽培。野生羊肚菌鮮味氨基酸＋甜味氨基酸的相對含量大于人工栽培羊肚菌并大于50%。通過FAAs的呈味作用，發(fā)現(xiàn)野生比人工栽培羊肚菌味道鮮美，相關研究結果與之相吻合[12]。

表4 不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs的TAVTable 4 TAVs of free amino acids in cultivated and wild Morchella from different provinces

表5 FAAs指標間相關性分析Table 5 Correlation analysis between free amino acids in cultivated and wild Morchella from different provinces

圖1 不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs呈味特性雷達圖Fig. 1 Radar chart of TAVs of free amino acids in cultivated and wild Morchella from different provinces

2.3 人工栽培和野生羊肚菌FAAs相關性分析

如表5所示，各氨基酸之間存在正相關也存在負相關，且絕大部分呈顯著正相關（P＜0.05），Lys、Asp、Glu、Gly、Cys等氨基酸之間相關性達較高水平，Leu、His與Val，Ser與Thr，Trp與Met，Leu與Ile，Pro與Trp之間相關系數(shù)在0.8以上呈正相關，Arg與Asp之間相關系數(shù)在0.8以上呈負相關，這表明羊肚菌FAAs間相關性較強，可通過PCA對不同省份的人工栽培和野生羊肚菌進行綜合評價。

2.4 人工栽培和野生羊肚菌FAAs的PC差異

由表6可知，由于前4 個PC對應特征值均大于1，累計方差貢獻率為87.125%，基本反映了所有變量的初始信息，故選取前4 個PC，反映不同省份羊肚菌FAAs的大部分信息。

表6 PC的特征值和貢獻率Table 6 Eigenvalues of principal components and their contribution rates to total variance

表7顯示了FAAs PCA矩陣中主要氨基酸在各PC矩陣中的權重系數(shù)，載荷上的數(shù)值反映原始變量對因子影響的大小，正負代表變化的方向。PC1的方差貢獻率為35.676%，主要反映Gly、Glu、Phe、Leu、Met、Asp、Trp、His、Pro的變異信息。PC2的方差貢獻率為31.521%，主要反映Lys、Cys、Thr、Ile、Ser、Tyr的變異信息。PC1和PC2反映了FAAs的大部信息，包括5 種甜味氨基酸、4 種苦味氨基酸和全部的鮮味、芳香族氨基酸。PC3方差貢獻率為13.977%，其載荷絕對值最大的前2 位是Val（苦）、Ala（甜）。PC4的方差貢獻率為5.951%，其載荷絕對值最大的前2 位是Tyr（芳香）、Ala（甜）。

表7 PC的特征向量與載荷矩陣Table 7 Principal component eigenvectors and loading matrix

由圖2可知，不同省份羊肚菌樣品的區(qū)分效果較好，12 個人工栽培和12 個野生羊肚菌的數(shù)據(jù)點均位于95%置信區(qū)間內。野生羊肚菌基本分布于PC1的正半軸和PC2的負半軸，聚集較好，說明不同省份野生羊肚菌FAAs組成及含量相近，而人工栽培羊肚菌分別分布在不同象限，說明不同省份人工栽培羊肚菌FAAs組成及含量差異較大。

圖2 不同省份人工栽培和野生羊肚菌的PCA得分圖Fig. 2 PCA score plot of cultivated and wild Morchella from different provinces

2.5 人工栽培和野生羊肚菌FAAs的綜合評價

由于PCA中前4 個PC反映了羊肚菌樣品中24 種FAAs信息的87.125%，因此利用前4 個PC進行不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs的綜合評價可行。利用PCA得到F1、F2、F3、F4的4 個新的綜合指標代替原來24 個指標對羊肚菌中FAAs進行分析，得到前4 個PC線性關系：

4 個PC從不同方面反映不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs的總體水平，單獨使用某一個PC并不能對其質量作出綜合性評價，因此以每個PC對應的方差相對貢獻率作為權重，對4 個PC得分進行權重加和，建立綜合評價函數(shù)F=0.409F1＋0.362F2＋0.160F3＋0.068F4，計算各品種的綜合得分，分數(shù)高低可反映不同省份及種類中FAAs綜合品質高低。由表8可知，4 個PC綜合得分前3的是RJ，得分最低的3 個為RS，排名4～10的羊肚菌中6 個為野生羊肚菌、1 個為人工栽培羊肚菌。整體來看，RJ羊肚菌氨基酸營養(yǎng)品質最高，RS羊肚菌品質相對較差。

表8 不同省份人工栽培和野生羊肚菌的成分得分和綜合評價Table 8 Principal component scores and comprehensive assessment of cultivated and wild Morchella from different provinces

2.6 聚類分析

采用SPSS Statistics 19軟件對8 類不同省份人工栽培和野生羊肚菌中FAAs品質進行聚類分析，采用Euclidean距離和Ward最小方差法進行系統(tǒng)聚類。如圖3所示，左側樹狀為不同省份人工栽培和野生羊肚菌間的聚類，上側樹狀為FAAs的聚類，中部填充顏色深淺，表示各類羊肚菌中氨基酸含量的高低，其中白色為未檢出，紅、藍系顏色越深則含量越高。從左側聚類看，8 個類別的羊肚菌可分為4大類：第1類為RJ，品質最好，Lys、Cys、Ser、His和Val含量較高，甜味氨基酸占優(yōu)勢；第2類為YY、RY、YG，品質較好，甜味氨基酸中的Thr、Ser、His含量較高；第3類為RG、YS、YJ，品質相對差，YJ中Arg的含量明顯低；第4類為RS，品質相對較差，其鮮味化合物Glu和甜味化合物Thr、Ser的含量最低。FAAs的聚類可分為3大類，Arg單獨作為一類，含量較高且與其他氨基酸相似性較弱。Glu、Ala和Thr作為一類，含量較高，作為鮮、甜味氨基酸的代表。其余氨基酸作為一類，含量相對低，以紅色和白色為主，各氨基酸間具有相似性。

羊肚菌中氨基酸品質的差異受區(qū)域、土壤、溫濕度及栽培料等因素的影響，該聚類分析與PCA結果相近，可較好地體現(xiàn)不同省份人工栽培和野生羊肚菌的差異性。這也為羊肚菌的栽培模式、氨基酸營養(yǎng)品質的評價及味覺感知等提供一定參考。

圖3 不同省份人工栽培和野生羊肚菌聚類分析圖Fig. 3 Dendrogram from cluster analysis of cultivated and wild Morchella from different provinces

3 結 論

羊肚菌營養(yǎng)豐富，滋味獨特，開展不同省份人工栽培和野生羊肚菌FAAs營養(yǎng)品質分析和綜合評價，篩選其主要的滋味活性，建立綜合評價模型，為羊肚菌種植區(qū)域的選取及野生資源的保護等提供理論依據(jù)和評價方法。

本實驗分析云南、四川、吉林、甘肅人工栽培和野生羊肚菌FAAs的組成及含量，人工栽培羊肚菌檢測到16 種FAAs（Trp和Pro未檢出），含量為20.77～43.07 mg/g，野生羊肚菌檢測到18 種FAAs，含量為29.04～35.48 mg/g。除了吉林省，其余省均為野生羊肚菌FAAs含量大于人工栽培羊肚菌。從各呈味氨基酸組成看，吉林省人工栽培羊肚菌的甜味、苦味及芳香族氨基酸含量均最高。Glu對羊肚菌的鮮味影響最大，野生羊肚菌TAV在13.75～17.79之間，人工栽培羊肚菌TAV在5.28～11.02之間，野生羊肚菌的鮮味明顯高于人工栽培羊肚菌，云南省野生羊肚菌鮮味最突出。苦味氨基酸中Arg的TAV最高，野生羊肚菌的苦味氨基酸含量小于人工栽培羊肚菌。PCA從18 種FAAs中提取4 個PC，累計方差貢獻率為87.125%，較好地反映羊肚菌FAAs品質的綜合信息，并建立綜合評價模型：F=0.409F1＋0.362F2＋0.160F3＋0.068F4，得分越高反映不同省份及種類間FAAs的綜合品質越好，人工栽培羊肚菌FAAs差異較大，RJ品質最好，RS品質相對較差。聚類分析將8 類不同省份人工栽培和野生羊肚菌分成4 類，結果與PCA相似，較好地反映不同省份間羊肚菌的差異性。

綜上所述，人工栽培羊肚菌受土壤、營養(yǎng)袋、種植模式及栽培技術等因素影響，使其FAAs品質間差異較大。野生羊肚菌在氨基酸組成及鮮美的滋味上有其獨特的優(yōu)勢，但對鮮味等成分的影響機理尚不清楚，人工栽培與野生羊肚菌氨基酸差異的主要因素有待進一步研究。