張鵬, 劉升明, 劉寶儀, 張爽, 張鑫, 黃炎明

江門市中心醫(yī)院 1重癥醫(yī)學(xué)科， 3醫(yī)學(xué)研究中心， 4呼吸與危重醫(yī)學(xué)科(廣東江門 529030)； 2暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學(xué)科(廣東廣州 510630)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是因肺內(nèi)外多種病因?qū)е碌姆蚊氀軗p傷后以急性進行性缺氧性呼吸衰竭為主要表現(xiàn)的綜合征[1]。由于多種病因均可導(dǎo)致ARDS，膿毒癥是最常見的病因。根據(jù)起始感染部位不同分為肺內(nèi)感染導(dǎo)致的ARDS(acute respiratory distress syndrome of pulmonary，ARDSp)及肺外感染導(dǎo)致的ARDS(acute respiratory distress syndrome of extrapulmonary，ARDSexp)。目前肺部微生態(tài)的研究還處于初級階段，微生態(tài)的變化與ARDS的關(guān)系如何，能否影響疾病的發(fā)生、發(fā)展值得我們深入探討。本研究將篩選肺內(nèi)感染ARDS與肺外感染ARDS及對照組(非ARDS)患者進行比較，分析不同病因的ARDS患者肺部微生態(tài)的差異，尋找膿毒癥導(dǎo)致的肺內(nèi)感染與肺外感染ARDS肺部微生物態(tài)的變化規(guī)律。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究采用的方案獲得江門市中心醫(yī)院倫理審查委員會審查批準(No：2019-15)。在使用纖支鏡進行支氣管肺泡灌洗收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本之前，已獲得患者或其法定代表人的書面知情同意書。

本研究回顧性分析2018年1月至2020年4月在江門市中心醫(yī)院ICU收治的18歲及以上由膿毒癥引起的ARDS，且獲得知情同意的病例共106例。

納入標準：(1)ARDS診斷符合2012年柏林定義[2]；(2)ARDS的病因由膿毒癥引起；(3)年齡>18歲，臨床資料完整。

排除標準：(1)ARDS由非感染因素引起；(2)年齡<18歲，臨床資料不完整。ARDS根據(jù)起始感染部位分為ARDSp組81例和ARDSexp組25例。收集在同時期收治ICU存在輕癥肺部感染非ARDS的患者作為對照組，共25例。

所有患者都在ICU氣管插管、機械通氣治療，均采用纖維支氣管鏡獲取BALF標本送檢[3]。收集標本時間：ARDS患者在診斷ARDS 24 h以內(nèi)、對照組患者在進入ICU 24 h以內(nèi)，均在當天使用抗生素前留取基線樣本，送檢驗科進行病原學(xué)培養(yǎng)。同時剩余標本送中心實驗室進行離心，保存在-20℃冰箱留作科研用途。最后標本統(tǒng)一送檢mNGS進行DNA基因測序，包括：核酸提取、文庫構(gòu)建、高通量測序、生物信息學(xué)分析、病原數(shù)據(jù)判讀[4]。

1.2 ARDS患者的臨床治療 所有膿毒癥患者按照膿毒癥指南[5]治療，結(jié)合臨床感染指標及影像學(xué)信息，采用經(jīng)驗性抗感染治療。ARDS患者按照ARDS通氣指南進行機械通氣治療[6-7]，抗感染方案綜合患者炎癥指標、影像學(xué)資料、微生物檢測結(jié)果作出調(diào)整。

1.3 病例信息的收集和分析 患者資料包括年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、起始感染部位。通過比較ARDSp組、ARDSexp組及對照組患者BALF的宏基因組測序結(jié)果，分析不同組別之間肺內(nèi)微生物組的異同。本研究測序共測出2 127種微生物，由于病原微生物占據(jù)大部分的測序信息，背景菌占比少且與病原微生物RPM數(shù)量差別太大，因此將病原微生物和背景菌群分別分析。根據(jù)2019年Chinet監(jiān)測數(shù)據(jù)[8]及測序?qū)嶒炇覚z測常見的病原微生物，提取常見院內(nèi)感染病原微生物，包括常見細菌、真菌、病毒及特殊病原體，共57種(表1)。其余的微生物考慮為背景微生物，整合以屬的水平共700種，分析背景菌群的變化。由于背景的真菌及病毒數(shù)較少，暫不分析。

表1 常見的病原微生物

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用GraphPad 5.0或R3.4.4軟件進行分析，使用2檢驗對每個菌群測序結(jié)果的陽性率進行比較：將RPM值≥1的病原微生物的定義為陽性，RPM<1定義為陰性；分析背景菌時，將RPM值>0定義為陽性，RPM=0定義為陰性。再進行2檢驗或Fisher檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的基本特征 本研究篩選出膿毒癥導(dǎo)致的ARDS患者106例，其中ARDSp組81例，ARDSexp組25例。對照組25例。比較ARDS組與對照組一般信息，年齡與性別比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。ARDS組中分ARDSp組與ARDSexp組比較：兩組基礎(chǔ)特征及診斷ARDS前的使用抗生素時間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表2 ARDS組與對照組一般信息比較 例(%)

表3 ARDSp組與ARDSexp組患者基礎(chǔ)特征及診斷ARDS前的使用抗生素時間的比較 例(%)

2.2 ARDSp組、ARDSexp組與對照組病原微生物的差異

2.2.1 ARDSp組與對照組病原微生物的差異 與對照組比較，ARDSp組檢測出溶血葡萄球菌、真菌、白色念珠菌、病毒等陽性率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。特殊病原體及其他病原微生物對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 ARDSp組與對照組病原微生物陽性率的差異

2.2.2 ARDSexp組與對組病原微生物的差異 與對照組比較，ARDSexp組檢測出大腸埃希菌的陽性率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.023)。見圖2。

圖2 ARDSexp組與對照組病原微生物陽性率的差異

2.2.3 ARDSp組與ARDSexp組病原微生物的差異 與ARDSexp組比較，ARDSp組檢測出病毒的陽性率更高(P=0.006)；而ARDSexp組對比ARDSp組檢測出鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌的陽性率更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。其他病原微生物對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 ARDSexp組與ARDSp組病原微生物陽性率的差異

2.3 ARDSp組、ARDSexp組與對照組背景菌群的差異

2.3.1 ARDSp組與對組背景菌群的差異 與對照組比較，ARDSp組檢測出鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、氫化桿菌屬(Hydrobacter)、Curvibacter、Pelomonas、不動桿菌(Acinetobacter)、代爾夫特菌屬(Delftia)、紅球菌屬(Rhodococcus)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、弧菌屬(Vibrio)、莫拉菌屬(Moraxella)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、微桿菌屬(Microbacterium)、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)、哈夫尼菌屬(Hafnia)、Mogibacterium、假黃單胞菌屬(Pseudoxanthomonas)、Mitsuaria等陽性率減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 ARDSp組與對照組背景菌群陽性率的差異

2.3.2 ARDSexp組與對照組背景菌群的差異 與對照組比較，ARDSexp組檢測出放線菌(Actinomyces)、孿生球菌屬(Gemella)、梭形桿菌屬(Fusobacterium)、卟啉菌屬(Porphyromonas)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、奇異菌屬(Atopobium)、克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)、瘤胃球菌(Ruminococcus)、Bibersteinia、藍綠藻菌屬(Lachnoclostridium)、毛螺旋菌屬(Lachnospiraceae)、梭菌屬(Clostridium)、歐文菌屬(Erwinia)、Odoribacter、亞特蘭蒂斯菌(Atlantibacter)、耶爾森菌(Yersinia)等陽性率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 ARDSexp組與對照組背景菌群陽性率的差異

2.3.3 ARDSexp組與ARDSp組背景菌群的差異 與ARDSp組比較，ARDSexp組檢測出緩生根瘤菌(Bradyrhizobium)、類分枝桿菌(Mycobacteroides)、孿生球菌屬、紅球菌屬、Cutibacterium、放線菌屬(Actinomyces)、甲基桿菌屬、梭形桿菌屬、顆粒鏈菌屬(Granulicatella)、Schaalia、卟啉菌屬、羅斯氏菌屬(Rothia)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、鞘脂菌屬、弧菌屬、密螺旋體屬(Treponema)、細小單胞菌(Parvimonas)、消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、纖毛菌屬(Leptotrichia)、勞特羅普氏菌屬(Lautropia)、假交替單胞菌、Trueperella、小桿菌屬(Dialister)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、Scardovia、伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)、毛螺旋菌屬、Mogibacterium、Bibersteinia、歐文菌屬、Blautia、梭菌屬、藍綠藻菌屬、真桿菌屬(Eubacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、亞特蘭蒂斯菌、瘤胃球菌、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、Tyzzerella、Odoribacter、阿克曼氏菌(Akkermansia)、Centipeda、Mediterranea、Basfia、Collinsella、加德納菌屬(Gardnerella)、皮桿菌屬(Dermabacter)、庫特氏菌屬(Kurthia)、醋弧菌屬(Acetivibrio)、Flavonifractor、Absiella、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、梭狀芽胞桿菌(Clostridiales)、Gordonibacter、Hungatella、磁螺菌屬(Magnetospirillum)、動彎桿菌屬(Mobiluncus)、Paraglaciecola、Phocea、Prevotellamassilia、Ruthenibacterium、Sneathia、Turicimonas等陽性率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 ARDSexp組與ARDSp組背景菌群陽性率的差異

3 討論

ARDS是臨床常見的危重急癥，隨著人們對ARDS病理生理認識和研究的不斷深入，治療方法和策略取得了巨大的進步，然而病死率居高不下。不同病因?qū)е碌腁RDS具有明顯異質(zhì)性，既往研究[9]已報道無論從發(fā)病機制、病理生理、機械通氣策略、預(yù)后等方面，肺內(nèi)源性與肺外源性ARDS都有一定的區(qū)別。因此需要從不同病因充分認識ARDS疾病的異質(zhì)性，從而選擇個體化治療策略。

本研究利用宏基因組二代測序技術(shù)通過比較ARDSp組和ARDSexp組基線水平的微生態(tài)情況，發(fā)現(xiàn)兩組之間有明顯區(qū)別。在病原微生物方面，因本研究ARDSp組起始感染是肺內(nèi)感染導(dǎo)致的，病原微生物并不局限于細菌，真菌、病毒、特殊病原體也是常見病原體。研究結(jié)果顯示ARDSp組比對照組檢測出溶血葡萄球菌、真菌、白色念珠菌、病毒的陽性率更高(P<0.05)，特殊病原體及其他病原微生物對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。ARDSexp組雖然起始感染部位在肺外，但其肺部由于腸道菌群的移位和條件致病菌的生長等原因也可以檢測出大量的病原微生物，如ARDSexp組比對照組檢測出大腸埃希菌的陽性率更高，ARDSexp組比ARDSp組鮑曼不動桿菌、醋酸鈣不動桿菌的陽性率更高。

在背景菌群方面，ARDSp組、ARDSexp組與對照組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。首先在菌群多樣性上，同時與對照組對比，發(fā)現(xiàn)ARDSp組的菌群多樣性明顯減少，而ARDSexp組菌群多樣性明顯增加。其主要原因考慮是ARDSp組起始感染在肺部，病原微生物的增加，抑制了正常呼吸道菌群的生長。同時嚴重感染導(dǎo)致肺泡上皮細胞破壞，肺泡塌陷、肺內(nèi)實變。由于生長環(huán)境受到嚴重破壞，正常的呼吸道菌群數(shù)量下降，最終菌群多樣性減少。雖然ARDSexp組由于嚴重膿毒癥引起肺血管通透性增加，肺間質(zhì)水腫，但上皮和內(nèi)皮層保持完整，呼吸道菌群生長的環(huán)境并未破壞。此外，血管通透性的增加可導(dǎo)致蛋白外滲，為細菌生長提供了豐富、必需的營養(yǎng)物質(zhì)，所以正常的呼吸道菌群并未減少，而且隨著腸道菌群移位和條件致病菌的生長，菌群多樣性明顯增加。Kyo等[10]分析ARDS患者BALF的肺微生物組發(fā)現(xiàn)，肺細菌負擔(dān)(16S rRNA基因拷貝數(shù))趨于增加，香農(nóng)指數(shù)提示α多樣性明顯降低，但結(jié)果并未區(qū)分肺內(nèi)源性和肺外源性，其主要致病原因為肺炎，約占65%，與本研究肺內(nèi)源性的結(jié)果相仿。另外，Dickson等[11]發(fā)現(xiàn)在盲腸結(jié)扎和穿刺致腹部膿毒癥的小鼠肺損傷實驗?zāi)Ｐ椭?，肺微生物組富含腸道細菌，且細菌多樣性增多。這與本研究肺外源性的結(jié)果一致。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，ARDSp組比對照組陽性率減少的背景菌有氫化桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、紅球菌屬、短波單胞菌屬、甲基桿菌屬、微桿菌屬、弧菌屬。多項研究表明[12-13]，鞘氨醇單胞菌屬、紅球菌屬、短波單胞菌屬、甲基桿菌屬等屬于肺部菌群，是肺部的條件致病菌。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)氫化桿菌屬可能是ARDS肺部的“益生菌”[14]。因此也證實了本研究的研究結(jié)果，ARDSp的微生態(tài)特點為病原微生物的豐度增加，其他肺部呼吸道“正?！本旱臏p少。再者，ARDSexp組比對照組陽性率增多了很多不同的背景菌群，這些菌群廣泛存在于自然界，有孿生球菌屬、梭形桿菌屬、卟啉菌屬、葡萄球菌屬等口腔、呼吸道來源[15-16]，也有屬于腸桿菌目的克呂沃爾氏菌屬、歐文菌屬、耶爾森菌等腸道菌群[18-20]。因此，ARDSexp的微生態(tài)特點為細菌負荷量增加、菌群多樣性增加、出現(xiàn)肺部條件致病菌和腸道菌群的增加。

本研究存在一定的局限性與不足：首先，本研究受臨床眾多因素影響，抗生素的使用可能影響呼吸道微生物群的變化；然而既往研究在創(chuàng)傷性ARDS患者中，抗生素的使用與肺部群落組成沒有顯著相關(guān)性[21]。而且本研究納入標準全是膿毒癥的ICU患者，在ICU按照膿毒癥指南標準化治療，因此抗生素的影響是最小的。本研究分析了ARDSp與ARDSexp組在診斷前使用抗生素時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而且回顧兩組均有使用抗腸道菌群的抗菌藥物。因此考慮ARDS出現(xiàn)腸道菌群的檢出率增加與抗感染方案選擇關(guān)系不大，日后腸道菌群的檢出率增加有可能成為診斷ARDS的一個新型標志物。其次，ARDSexp組與對照組患者的數(shù)量有限，對照組并不是完全沒有呼吸系統(tǒng)疾病的患者，但考慮難以在正常人進行有創(chuàng)的纖維支氣管鏡留取支氣管肺泡灌洗液，因此這些因素可能對本研究結(jié)果有一定的偏倚。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：張鵬：論文撰寫、收集標本、分析數(shù)據(jù)；劉升明、黃炎明：課題設(shè)計；劉寶儀、張鑫：數(shù)據(jù)分析，張爽：收集標本、整理臨床數(shù)據(jù)。