曹凡，陳琳，宋忠興，唐志書，3*，倪?。?陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 7000；.陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，秦藥特色資源研究開(kāi)發(fā)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（培育），陜西省創(chuàng)新藥物研究中心，陜西 咸陽(yáng) 7083；3.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院，北京 00700；4.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 0009）

中藥復(fù)方制劑金茵利膽膠囊由茵陳、金錢草、郁金和枳殼四味藥材加工制成，具有疏肝利膽、清熱除濕之功效，臨床上廣泛應(yīng)用于肝膽濕熱證的改善，療效顯著。茵陳、金錢草作為“保肝要藥”“排石金藥”，常作為保肝利膽的藥材在復(fù)方中發(fā)揮作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茵陳中主要是綠原酸、對(duì)羥基苯乙酮、6，7-二甲氧基香豆素、茵陳色原酮等化學(xué)成分發(fā)揮利膽作用，且綠原酸有很好的保肝作用。金錢草全草含有槲皮素等黃酮類化合物以及多糖等成分，具有清熱解毒、抗炎、利濕退黃等藥理活性。

金茵利膽膠囊現(xiàn)行企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“含量測(cè)定”項(xiàng)下，規(guī)定采用枳殼中柚皮苷作為檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定，本品每粒含枳殼以柚皮苷（CHO）計(jì)，不得少于0.8 mg，以達(dá)到對(duì)金茵利膽膠囊進(jìn)行質(zhì)量控制的目的。單一成分的含量測(cè)定不能對(duì)制劑的質(zhì)量進(jìn)行全面有效控制。市面上金茵利膽相關(guān)復(fù)方制劑還包括金茵利膽口服液、金茵利膽靈合劑以及金茵利膽顆粒。筆者通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)僅有金茵利膽口服液指紋圖譜、柚皮苷和橙皮苷含量測(cè)定以及金茵利膽顆粒中綠原酸含量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道，未見(jiàn)金茵利膽膠囊化學(xué)成分的定性定量分析。本研究采用HPLC 對(duì)15 批金茵利膽膠囊樣品進(jìn)行相似度分析，建立其譜效關(guān)系，以期為金茵利膽膠囊的指標(biāo)性成分篩選以及質(zhì)量控制提供有效的分析方法和數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 安捷倫）；Milli-Q 純水/超純水一體機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；ME204 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；CPA225D 電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；KQ-300DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；VORTEX-5 漩渦混勻儀（海門其林貝爾儀器有限公司）。

新綠原酸（批號(hào)：HR20422B1）、隱綠原酸（批號(hào)：HR20423B1）、綠原酸（批號(hào)：HCD21133198）、1，3-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ?hào)：H0071330198）（對(duì)照品，寶雞辰光生物科技有限公司）；對(duì)羥基苯乙酮（批號(hào)：111897-201602）、柚皮苷（批號(hào)：110722-201815）、新橙皮苷（批號(hào)：1108091857-201804）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；各對(duì)照品純度均大于98%。金茵利膽膠囊（S1 ～S15，批號(hào)：20200301，20200302，20200401，20200402，20200403，20200404，20200501，20200601，202000901，20200902，20201001，20201002，20201003，20201004，20201101，陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。甲醇（分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Honeywell公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱InertSustain C（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相0.05% 磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～8 min，5%～12%B；8 ～14 min，12% ～15%B；14 ～26 min，15% ～27%B；26 ～30 min，27% ～28%B；30 ～41 min，28% ～40%B；41 ～54 min，40% ～80%B；54 ～55 min，80%～5%B；55 ～65 min，5%B；后運(yùn)行5 min）； 流速1.0 mL·min； 柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm；進(jìn)樣量5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、對(duì)羥基苯乙酮、柚皮苷和新橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇配成單一對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。吸取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.3、0.3、0.167、0.1、0.133、0.6、0.3 mg·mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，4℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取金茵利膽膠囊內(nèi)容物約0.3 g，精密加入70% 甲醇9 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min（功率300 W，頻率40 kHz，超聲溫度45 ℃），放冷，70% 甲醇補(bǔ)足，搖勻，3000 r·min離心2 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例取金錢草、茵陳、郁金和枳殼單味藥材以及缺金錢草、缺茵陳、缺郁金和缺枳殼的樣品，按金茵利膽膠囊生產(chǎn)工藝制備，過(guò)濾，濃縮，噴霧干燥，得到各單味藥材以及陰性樣品干燥粉末，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 取同一批金茵利膽膠囊樣品（批號(hào)：20190902）制備成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖中各峰面積。以21 號(hào)峰（柚皮苷）為參照峰，23 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

值均小于1.0%，相對(duì)峰面積的

RSD

值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。2.3.2 重復(fù)性 取同一批金茵利膽膠囊樣品（批號(hào)：20190902）制備成供試品溶液6 份，進(jìn)樣測(cè)定。以21 號(hào)峰（柚皮苷）為參照峰，23 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

值均小于1.0%，相對(duì)峰面積的

RSD

值均小于3.0%，表明本方法的重復(fù)性良好。2.3.3 穩(wěn)定性 取同一批金茵利膽膠囊樣品（批號(hào)：20190902）制備成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 各進(jìn)樣1 次，記錄色譜峰面積。以21 號(hào)峰（柚皮苷）為參照峰，23 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間

RSD

值均小于1.0%，相對(duì)峰面積的

RSD

值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 多批樣品指紋圖及共有峰 精密稱取15批金茵利膽膠囊內(nèi)容物約0.3 g，制成供試品溶液。取供試品溶液各5 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。采用國(guó)家藥典委員會(huì)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）”，分析15 批樣品HPLC 色譜圖，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.3 min，采用中位數(shù)法；通過(guò)多點(diǎn)校正后，全峰匹配圖譜；得到15 批金茵利膽膠囊樣品的指紋圖譜共有模式見(jiàn)圖1，得到23 個(gè)共有峰。

圖1 15 批金茵利膽膠囊的HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 15 batches of Jinyin Lidan capsules

2.4.2 相似度評(píng)價(jià) 以S1 為對(duì)照?qǐng)D譜，對(duì)金茵利膽膠囊樣品的指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果顯示，15 批金茵利膽膠囊樣品的指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.900。

2.4.3 特征峰的指認(rèn)及歸屬 根據(jù)色譜峰保留時(shí)間穩(wěn)定、峰面積相對(duì)較高及檢測(cè)率達(dá)100%的原則，經(jīng)過(guò)與混合對(duì)照品PDA 光譜圖對(duì)比，共指認(rèn)了其中7 個(gè)共有峰，分別為新綠原酸（9 號(hào)峰）、隱綠原酸（13 號(hào)峰）、綠原酸（14 號(hào)峰）、1，3-二咖啡?？鼘幩幔?6 號(hào)峰）、對(duì)羥基苯乙酮（17 號(hào)峰）、柚皮苷（21 號(hào)峰）、新橙皮苷（23 號(hào)峰）?；旌蠈?duì)照品和代表性樣品（S1）的HPLC 圖見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品（A）、金茵利膽膠囊 S1（B）的HPLC 圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed control（A）and Jinyin Lidan capsule S1（B）

分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL，記錄色譜圖。依據(jù)各色譜峰的紫外吸收光譜和相對(duì)保留時(shí)間，確定各特征峰的歸屬。其中，9 號(hào)峰新綠原酸、13 號(hào)峰隱綠原酸、14 號(hào)峰綠原酸、16 號(hào)峰1，3-二咖啡?？鼘幩?7 號(hào)峰對(duì)羥基苯乙酮?dú)w屬于茵陳，21 號(hào)峰柚皮苷歸屬于枳殼，23 號(hào)新橙皮苷歸屬于茵陳、枳殼。各藥材、陰性樣品以及樣品的HPLC 圖見(jiàn)圖3。

圖3 金茵利膽膠囊、單味藥材以及各陰性藥材HPLC 圖Fig 3 Chromatogram of Jinyin Lidan capsule，single medicinal materials and negative medicine materials

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 供試品溶液的制備 對(duì)金茵利膽膠囊中的4 味藥材粉末進(jìn)行U（7）均勻設(shè)計(jì)，茵陳按0 ～2400 mg，金錢草、郁金均按0 ～1200 mg，枳殼按0 ～600 mg 配比，得到7 組樣品配比，另外按處方原配比增設(shè)一組樣品N0，共計(jì)8 個(gè)樣品配比組（見(jiàn)表1）。根據(jù)均勻設(shè)計(jì)表的配比，加入樣品總重量10 倍量的70%甲醇溶解提取藥材粉末，超聲50 min，離心，取上清液，過(guò)0.45 μm 濾膜，水浴揮干甲醇。用原樣本體積15%DMSO 復(fù)溶，渦旋超聲溶解，作為供試品儲(chǔ)備溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 金茵利膽膠囊U (7)均勻設(shè)計(jì)表
Tab 1 U (7) uniform design of Jinyin Lidan capsules

序號(hào)茵陳/mg金錢草/mg郁金/mg枳殼/mg N01200600600300 N10200400500 N24006001000400 N38001000200300 N412000800200 N516004000100 N620008006000 N7240012001200600

2.5.2 DPPH 自由基清除率 精密稱取7.88 mg DPPH 粉末，加無(wú)水乙醇定容至100 mL，得0.2 mmol·LDPPH 自由基儲(chǔ)備液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取“2.5.1”項(xiàng)下一定量的供試品儲(chǔ)備溶液，加70% 甲醇配成系列質(zhì)量濃度的供試品溶液（1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 25 mg·mL）。各吸取供試品溶液100 μL、DPPH 自由基溶液100 μL 于96 孔板中，室溫下避光反應(yīng)30 min，采用酶標(biāo)儀于517 nm 處測(cè)定DPPH 自由基溶液＋系列質(zhì)量濃度的供試品溶液吸光度（

A

），系列質(zhì)量濃度的供試品溶液（100 μL）＋70% 甲醇（100 μL）吸光度（

A

），DPPH 自由基溶液（100 μL）＋70%甲醇（100 μL）同法測(cè)吸光度（

A

）。維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照，清除率＝[

A

－（

A

－

A

）]/

A

，采用SPSS Statistics 25 中Probit 模型預(yù)測(cè)半數(shù)抑制濃度（

IC

），結(jié)果見(jiàn)表2。2.5.3 ABTS 自由基清除率 分別配制7 mmol·LABTS 水溶液和2.45 mmol·LKSO水溶液，同體積混合，暗處放置12 ～16 h，使用前加蒸餾水稀釋，使其在734 nm 處吸光度為（0.8±0.02），即得ABTS 工作液。取“2.5.1”項(xiàng)下一定量的供試品儲(chǔ)備溶液，加70%甲醇配成系列質(zhì)量濃度的供試品溶液（1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg·mL）。分別吸取各供試品溶液20 μL、ABTS 自由基工作液180 μL 于96 孔板中，室溫下避光反應(yīng)10 min，采用酶標(biāo)儀于734 nm 處測(cè)定ABTS 自由基溶液＋系列質(zhì)量濃度的供試品溶液吸光度（

A

），系列質(zhì)量濃度的供試品溶液（180 μL）＋70% 甲醇（20 μL）的吸光度（

A

），DPPH 自由基溶液（180 μL）＋70% 甲醇（20 μL）的吸光度（

A

）。維生素C 作為陽(yáng)性對(duì)照，采用SPSS Statistics 25 中Probit 模型預(yù)測(cè)半數(shù)抑制濃度（

IC

），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品N0 ～N7 結(jié)果
Tab 2 of sample N0 ～N7

編號(hào)IC50/（mg·mL－1）DPPHABTS維生素C0.0370.016 N00.1780.085 N10.8930.160 N20.2470.157 N30.1700.130 N40.2550.135 N50.2340.151 N60.2000.146 N70.2010.118

由表2 可以看出，不同配比的N0 ～N7 樣品均具有一定的抗氧化活性，且都弱于維生素C。綜合來(lái)看，N0抗氧化活性較強(qiáng)，N1抗氧化活性最弱。

3 指紋圖譜與抗氧化活性的灰色關(guān)聯(lián)分析

將清除DPPH 自由基和清除ABTS 自由基的

IC

作為母序列，23 個(gè)共有峰峰面積作為子序列，參照文獻(xiàn)方法，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理，標(biāo)準(zhǔn)化處理后，計(jì)算母序列與子序列絕對(duì)差得到絕對(duì)差序列，進(jìn)而求得關(guān)聯(lián)系數(shù)得到關(guān)聯(lián)度，分辨系數(shù)

ρ

取0.5。

各子序列對(duì)母序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)平均值即得各色譜峰與DPPH 和 ABTS 活性的關(guān)聯(lián)度值，見(jiàn)表3 和4。將各子序列對(duì)母序列的關(guān)聯(lián)度按大小順序排列起來(lái)，組成關(guān)聯(lián)序。依據(jù)關(guān)聯(lián)度大小，確定了N0 ～N7 樣品中各成分對(duì)清除DPPH 和ABTS 自由基活性貢獻(xiàn)的大小順序。

表3 金茵利膽膠囊的指紋圖譜與DPPH 自由基清除活性的關(guān)聯(lián)序
Tab 3 Correlation between the fingerprint of Jinyin Lidan capsule and DPPH free radical scavenging activity

關(guān)聯(lián)序峰號(hào)關(guān)聯(lián)度關(guān)聯(lián)序峰號(hào)關(guān)聯(lián)度1120.780 13 30.735 2 90.757 14 40.735 3140.757 15190.726 4100.757 16210.726 5230.755 17110.724 6 80.755 18220.720 7170.754 19 20.719 8130.754 20180.709 9 70.754 21150.664 10200.750 22 10.636 11 50.744 23160.503 12 60.739

表4 金茵利膽膠囊的指紋圖譜與ABTS 自由基清除活性的關(guān)聯(lián)序
Tab 4 Correlation between the fingerprint of Jinyin Lidan capsule and ABTS free radical scavenging activity

關(guān)聯(lián)序峰號(hào)關(guān)聯(lián)度關(guān)聯(lián)序峰號(hào)關(guān)聯(lián)度1120.702 13190.646 2140.675 14210.646 3230.675 15 30.643 4100.674 16 40.642 5170.671 17220.638 6 80.671 18110.633 7130.671 19 20.623 8 90.669 20180.621 9 70.667 21150.565 10200.663 22 10.508 11 50.655 23160.403 12 60.649

對(duì)不同配比的N0 ～N7 樣品的HPLC 指紋圖譜中23 個(gè)共有峰峰面積與其抗氧化活性進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度以及關(guān)聯(lián)序分析，根據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小確定各色譜峰對(duì)抗氧化活性的貢獻(xiàn)度。綜合兩者結(jié)果可以看出，峰12 抗氧化活性貢獻(xiàn)度最強(qiáng)，峰14 抗氧化活性貢獻(xiàn)度次之，峰16（1，3-二咖啡?？鼘幩幔┛寡趸钚载暙I(xiàn)度最弱，其中指紋圖譜指認(rèn)出峰14 為綠原酸、峰9 為新綠原酸、峰17 為對(duì)羥基苯乙酮、峰13 為隱綠原酸、峰23 為新橙皮苷關(guān)聯(lián)度排名靠前，具有一定的抗氧化貢獻(xiàn)力，反映出這幾個(gè)峰是其抗氧化藥效較為重要的色譜峰，在復(fù)方中發(fā)揮抗氧化的作用較大。

4 討論

本研究對(duì)15 批次金茵利膽膠囊進(jìn)行指紋圖譜分析?？疾炝艘译?水、甲醇-水以及乙腈-不同比例（0.05%，0.1%）的甲酸、磷酸等含酸溶液作為流動(dòng)相，不同檢測(cè)波長(zhǎng)（256、282、310、320 nm），不同柱溫（25、30 及45℃）以及不同流速（0.8、1.0 mL·min）對(duì)金茵利膽膠囊中化學(xué)成分的分離能力，結(jié)果乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動(dòng)相，柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL·min，檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm 下進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，主要色譜峰分離度＞1.5，出峰數(shù)量較多，譜圖清晰，具有很好的分離效果。接著考察不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇以及水）、藥材 ∶ 溶劑比例（1∶20、1∶30、1∶40、1∶80）、超聲時(shí)間（30、60、90 min）以及超聲溫度（25、45、60℃）對(duì)金茵利膽膠囊內(nèi)容物化學(xué)成分提取的影響，最終選擇70% 甲醇，藥材∶溶劑比為1∶30，30 min 作為超聲時(shí)間，45℃作為超聲溫度為最優(yōu)條件對(duì)金茵利膽膠囊化學(xué)成分進(jìn)行提取。

本研究還以清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的

IC

來(lái)評(píng)價(jià)均勻設(shè)計(jì)的8 個(gè)金茵利膽膠囊樣品的抗氧化活性。結(jié)果表明均勻設(shè)計(jì)的8 個(gè)金茵利膽膠囊樣品均具有一定的抗氧化活性，綜合分析，N0 抗氧化活性最強(qiáng)，N1 抗氧化活性最弱，N0 抗氧化活性最強(qiáng)可能的原因?yàn)樵街兴奈吨兴幍呐浔缺容^合適，所提取出的復(fù)方中的成分使其抗氧化活性最強(qiáng)。本研究還采用灰色關(guān)聯(lián)度分析方法，將N0 ～N7 樣品HPLC 譜圖與其抗氧化作用的關(guān)聯(lián)度進(jìn)行量化分析。結(jié)果顯示，不同配比的N0 ～N7 樣品23 個(gè)共有峰與DPPH 清除率的關(guān)聯(lián)度在0.780 ～0.503，與ABTS 清除率的關(guān)聯(lián)度在0.702 ～0.403。其中，峰9 為新綠原酸、峰14 為綠原酸、峰17 為對(duì)羥基苯乙酮、峰13 為隱綠原酸、峰23 為新橙皮苷，這幾個(gè)峰是其抗氧化藥效較為重要的色譜峰，峰12 抗氧化活性最大，具體是哪種成分有待進(jìn)一步鑒定。

綜上所述，本研究采用HPLC 的方法建立了金茵利膽膠囊的指紋圖譜，共標(biāo)定了23 種共有峰，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度分析的統(tǒng)計(jì)方法，將金茵利膽的“譜”與“效”進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為金茵利膽抗氧化活性成分的篩選及其質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)提供參考。