張紀(jì)利，齊 是，欒新博，金亞波，黃崇峻，黎 平，韋建玉，顏 健

（1.廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 530001；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南熱帶農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)與循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642）

【研究意義】眾所周知，植物病原微生物在植株根際定殖的數(shù)量是決定能否侵染植株的關(guān)鍵，所以土傳病害的發(fā)生是與土壤中病原菌數(shù)量變化呈一定關(guān)系的［1-2］。一般認(rèn)為，土傳病原菌存在于土壤中，當(dāng)土壤中病原菌數(shù)量激增對(duì)植株的侵染就會(huì)越發(fā)嚴(yán)重，待病原菌突破植株的自身防御體系便可以引發(fā)土傳病害。因此，在種植初期和發(fā)病早期對(duì)潛伏在土壤中的病原菌數(shù)量進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于監(jiān)測(cè)田間病害的發(fā)生，并針對(duì)性的選擇化學(xué)或者生物等防控技術(shù)手段，將病原菌數(shù)量控制在發(fā)病閾值內(nèi)，從而減小經(jīng)濟(jì)損失［3］。

【前人研究進(jìn)展】目前，常用的病原菌檢測(cè)方法主要包括分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和LAMP 技術(shù)等［4-6］。相對(duì)于普通PCR，熒光定量PCR（qPCR）靈敏度更高，具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、假陽(yáng)性低、可量化等優(yōu)點(diǎn)。此外，qPCR 可以檢測(cè)到土壤中無(wú)法分離培養(yǎng)的微生物，從而克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的局限性。qPCR 是在普通PCR 反應(yīng)體系中加入特定的熒光結(jié)合物或熒光探針，然后通過特定的熒光識(shí)別儀器，實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，得到模板基因通過擴(kuò)增達(dá)到熒光檢測(cè)閾值所需的循環(huán)數(shù)（Ct 值），再根據(jù)已建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定模板中的基因表達(dá)量，推導(dǎo)出在目標(biāo)樣本內(nèi)病原菌的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的定量［7］。該技術(shù)在植物病害檢測(cè)中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，如王倩等［8］建立了qPCR 分子檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于土壤中早疫病菌茄鏈格孢（Alternaria solani）的檢測(cè)；陳清清等［9］利用qPCR 方法檢測(cè)小麥枯萎病菌索氏平臍蠕孢（Bipolaris sorokiniana）；Maud 等［10］建立了引起麥瘟病的稻瘟病菌（Pyricularia Oryzae）的qPCR 檢測(cè)方法；Eduardo 等［11］建立了一種精確檢測(cè)土壤和草莓植株中的茄病鐮刀菌（Fusarium solani）方法用于預(yù)測(cè)土傳病害枯萎病的發(fā)生。

【本研究切入點(diǎn)】枯萎病和煙草黑脛病是植煙土壤中最為常見的主要土傳病害，其病原菌分別是尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和煙草疫霉（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）。尖孢鐮刀菌是一種土傳病原真菌，能引起植物枯萎病和根腐病，該菌能侵染茄科、芭蕉科、薔薇科、葫蘆科、十字花科和豆科等100 種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的作物。尖孢鐮刀菌在植株根部維管束中定殖，導(dǎo)致導(dǎo)管堵塞，地上部分枯萎，根表皮產(chǎn)生褐色壞死斑，后期根部腐爛甚至整株植株死亡，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量以及品質(zhì)［12］。煙草疫霉引起的真菌性病害，該病廣泛分布于我國(guó)各大煙區(qū)，是我國(guó)煙草上最具毀滅性的病害之一。該病多數(shù)發(fā)生于煙草成株期，少數(shù)發(fā)生于苗床期。該病原菌寄主廣泛，除煙草外還可侵染辣椒、黃瓜、番茄等多種植物的根、莖和葉，侵染后植株出現(xiàn)根系壞死、葉片黃化、植株萎蔫甚至枯死等癥狀［13］?？梢姡羵鞑『τ捎诰哂泻軓?qiáng)的傳染性，很難根治，提前檢測(cè)及事先預(yù)防極為重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用PCR 預(yù)擴(kuò)增，qPCR 后擴(kuò)增定量的思路，建立同時(shí)檢測(cè)兩種病原菌的技術(shù)，該檢測(cè)技術(shù)為煙草種植過程中枯萎病和煙草黑脛病的病害發(fā)生和防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試土壤 發(fā)病土壤與健康土壤于2020 年6－7 月采集自廣西百色植煙區(qū)植煙土壤和廣東韶關(guān)煙區(qū)植煙土壤，田間煙草病害發(fā)生情況按《煙草病蟲害分級(jí)及調(diào)查方法》(GB/23222-2008)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查。每個(gè)樣地按照五點(diǎn)取樣法，其中煙草疫霉菌土樣33 份，鐮刀菌土樣9 份，健康土樣22 份，土壤取樣后裝入無(wú)菌自封袋中，放入液氮中冷藏，最后放于-80 ℃冰箱保存。室內(nèi)分析試驗(yàn)于2020 年6 月至2021 年3 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)完成。

1.1.2 供試病原菌及培養(yǎng)條件 枯萎病菌尖孢鐮刀菌（F.oxysporum，菌種編號(hào)3.18025）購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC；煙草黑脛病病原菌寄生疫霉煙草致病變種（P.parasiticavar.nicotianae，BNCC354348）購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)微生物技術(shù)研究所。購(gòu)買的菌種均按照對(duì)應(yīng)所購(gòu)公司提供的操作步驟說明書和培養(yǎng)條件進(jìn)行復(fù)蘇和擴(kuò)繁，其中尖孢鐮刀菌使用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，寄生疫霉煙草致病變種使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基培養(yǎng)。保藏方法：尖孢鐮刀菌和寄生疫霉煙草致病變種均通過打孔器取平板菌種生長(zhǎng)邊緣的菌餅于25%甘油中貯存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.1.3 培養(yǎng)基和主要耗材 PDA 培養(yǎng)基購(gòu)于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，瓊脂20 g/L。真菌基因組DNA 快速抽提試劑盒和細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒均購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司。

1.1.4 主要設(shè)備 LRH 系列生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；ZHWY-103D 恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；高壓滅菌器（日本Hirayama Manufacturing公司）；電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；UV-2450 紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices 公司）；恒溫培養(yǎng)震蕩器（天津歐諾儀器股份有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；NanoDrop One 微量紫外可見分光光度計(jì)（賽默飛世爾科技有限公司）；C1000 Touch PCR 儀/96孔梯度PCR 儀（美國(guó)Bio-rad 伯樂有限公司）；Applied BiosystemsqPCR 儀（北京新陽(yáng)創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原微生物特異性引物的篩選 病原微生物基因組DNA 提?。簾煵菀呙购图怄哏牭毒【z100 mg 于離心管中，按照上海生工細(xì)菌基因組DNA 快速抽提試劑盒提取。DNA 提取結(jié)果通過Nanodrop One 檢測(cè)DNA 濃度和質(zhì)量。

引物特異性篩選：針對(duì)煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌的ITS 序列，通過查閱文 獻(xiàn)［14-15］獲得多對(duì)引物（煙草疫霉：NIC (F:CCACCACGCAGCAAACTGCGGC,R:C A T T G A G T A G C C A G A G T C C G T C，P n i c (F:A A C C G A A G C T G C C A C C T A C,R:GAACAATGCAACTTATTGGACGTTT)，P n 3（F:G A C A A A C C A G T C G C C A A T T T,R:TGAACGCATATTGCACTTCC）；鐮刀菌引物YD (F:GCAGCGAGACCGCCACTAGATTT,R:T G C C T G T T C G A G C G T C A T T T C A)，J B (F:C A T A C C A C T T G T T G T C T C G G C,R:G A A C G C G A A T T A A C G C G A G T C)，AFP308 (F:CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA,R:CGAATTAACGCGAGTCCCAAC)，分別以3 種病原菌基因組DNA 和空白（水）對(duì)照為模板驗(yàn)證引物的特異性，建立PCR 和qPCR 擴(kuò)增的反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下：

PCR 反應(yīng)體系：20 μL ：2 × Taq PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，模板DNA 濃度為100 ng，剩余用ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，15 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

qPCR 反應(yīng)體系：15 μL：3 × Taq qPCR Master Mix 5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.3 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.6 μL，模板DNA (PCR 反應(yīng)產(chǎn)物) 1 μL，剩余用ddH2O 補(bǔ)足至15 μL。qPCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。

1.2.2 病原菌熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 通過試劑盒提取的煙草疫霉和鐮刀菌基因組DNA，按照模板濃度100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001 ng 加入qPCR 體系中，按照引物篩選特異性方法中的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，通過儀器檢測(cè)到的Ct 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 土壤DNA 提取方法優(yōu)化 隨機(jī)選擇8 份土壤樣本，在Omega Bio-tek Soil DNA Kit D5625試劑盒的基礎(chǔ)上進(jìn)行操作優(yōu)化。優(yōu)化主要是通過改變單因素變量，然后用NanoDrop One 測(cè)定DNA 濃度和質(zhì)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。具體如下：針對(duì)樣本土壤干濕度程度，將土樣平分為兩份，其中一份置于60 ℃烘箱中烘干2 h，另一份作為對(duì)照。針對(duì)研磨程度，將土樣平分為兩份，其中一份置于研缽中研磨細(xì)，肉眼看不到塊狀顆粒為止，另一份作為對(duì)照。洗脫次數(shù)，以30 μL的洗脫溶劑洗脫第一次，然后再吸取上次洗脫液進(jìn)行二次洗脫，得到的DNA，都用NanoDrop One 測(cè)定DNA濃度和質(zhì)量。

1.2.4 土樣PCR 預(yù)擴(kuò)增和qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件 以植煙土壤中提取的土壤微生物DNA 為模板，其余的PCR 預(yù)擴(kuò)增和qPCR 反應(yīng)體系和條件與驗(yàn)證引物特異性方法的相同。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用WPS2019 和office 進(jìn)行整理和作圖，采用SPSS17.0 進(jìn)行多重比較，使用鄧肯式新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌引物特異性篩選

各取100 ng 煙草疫霉菌、尖孢鐮刀菌，然后分別與一組非靶標(biāo)病原菌（水、青枯菌、鐮刀菌或者水、青枯菌、煙草疫霉菌）的基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增并結(jié)合PCR的目標(biāo)條帶（圖1）及qPCR的溶解曲線（圖2）與Ct 值結(jié)果，篩選出兩對(duì)引物，分別為煙草疫霉菌Pn3（正向引物：GACAAACCAGTCGCCAATTT；反向引物：TGAACGCATATTGCACTTCC）、尖孢鐮刀菌JBR（正向引物：CATACCACTTGTTGTCTCGGC；反向引物：GAACGCGAATTAACGCGAGTC）。

2.2 兩種病原菌熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以10 倍濃度梯度稀釋的病原菌DNA 為模板進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，以模板濃度的對(duì)數(shù)為x軸，以Ct 值為y軸作回歸曲線，獲得熒光定量檢測(cè)2 種病原菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)在模板濃度1×102～1×10-4ng 之間具有良好的線性關(guān)系（圖3），線性范圍可達(dá)6 個(gè)數(shù)量級(jí)。煙草疫霉相關(guān)系數(shù)R2為0.9972、斜率為-3.6038，截距為18.588，最終得出模板濃度與循環(huán)閾值之間的線性關(guān)系曲線公式為：y=-3.6038x+18.588。鐮刀菌相關(guān)系數(shù)R2為0.9447、斜率為-3.8693，截距為26.25，最終得出模板濃度與循環(huán)閾值之間的線性關(guān)系曲線公式為：y=-3.8693x+26.25。溶解曲線（圖2）分析表明，兩種病原菌溶解曲線均是單一峰，無(wú)明顯雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物Tm 值均一，煙草疫霉82.5（±0.5）℃，鐮刀菌83.5（±0.5）℃，表明換擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增。

圖3 10 倍梯度稀釋的煙草疫霉和尖孢鐮刀菌DNA的qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 qPCR standard curves of DNA of Phytophthora parasitica var.nicotianae and Fusarium oxysporum with 10-fold serial dilutions

2.3 土壤DNA 提取方法優(yōu)化

在按照Omega Bio-tek Soil DNA Kit D5625 試劑盒的基礎(chǔ)上針對(duì)樣品土壤的干燥、研磨、洗脫次數(shù)分別進(jìn)行優(yōu)化處理，結(jié)果見圖4。相較于潮濕的土壤，風(fēng)干后的土壤提取的DNA 濃度明顯更高（圖4A）。相對(duì)于未研磨的樣品，研磨后的樣品提取的DNA 濃度明顯更高（圖4B），可能是因?yàn)檠心ズ蟮耐寥琅c裂解酶的接觸面積更大，更利于細(xì)胞破壁使更多DNA 釋放出來，得到DNA數(shù)量自然就更多。最后因?yàn)楸狙芯拷⒌亩螣晒舛縋CR 方法所需的DNA 模板體積較小，所以通過30 μL的Elution Buffer 進(jìn)行二次洗脫可以明顯增加DNA 濃度（圖4C），以達(dá)到體系中所需的DNA 模板量。

圖4 土壤DNA 提取方法優(yōu)化Fig.4 Optimization of soil DNA extraction method

2.4 土傳病害土壤采集及二次熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果

從廣西百色植煙區(qū)采集健康和發(fā)病土壤樣本，從中選出具有一定代表性的土壤作為測(cè)試對(duì)象，檢測(cè)結(jié)果見圖5。

圖5 植煙土壤中2 種病原菌數(shù)量檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Detection results of the quantities of Fusarium oxysporum and Phytophora parasitica var.nicotianae in tobacco planting soil

采集的土壤按照已建立的檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，從圖5 可以看出，煙草疫霉菌在黑脛病發(fā)病土壤和健康土壤中差異不顯著，可能是因?yàn)闊煵菀呙辜纳谒拗髦参镏?，在煙稈還田前土壤中病原菌數(shù)量較健康土壤差異不明顯，尖孢鐮刀菌同樣在發(fā)病和健康土壤中不明顯。

3 討論

土壤是作物生長(zhǎng)的根本，也是微生物生長(zhǎng)的沃土，土壤中存在數(shù)量巨大、種類繁多的微生物，它們中的絕大部分是有益的，在土壤發(fā)育、物質(zhì)轉(zhuǎn)化、結(jié)構(gòu)形成、提高作物養(yǎng)分有效性、抑制病原菌活性等方面發(fā)揮著不可替代的作用［16］。但是，土壤中也存在著另一類引起作物病害的有害微生物，通稱為病原微生物。土傳病害的發(fā)生與土壤中病原微生物的數(shù)量及種類的致病力息息相關(guān)。

分子生物學(xué)檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行植物病原菌檢測(cè)的重要手段［17］。土壤中微生物DNA 提取的質(zhì)量關(guān)系到微生物數(shù)量，土壤基因組DNA 包括土壤中的微生物和動(dòng)植物遺體等的總DNA，而且傳統(tǒng)的DNA 提取方法［18-19］很難有效除去土壤中的腐殖質(zhì)等抑制因子。這種抑制因子在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR 中會(huì)影響酶的活力及反應(yīng)體系，使最終的結(jié)果誤差較大。傳統(tǒng)的DNA 提取方法所需土壤樣品量大、操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不利于大批量的DNA 提?。?0-21］，所以本實(shí)驗(yàn)選擇通過試劑盒法進(jìn)行DNA提取［22］，且在試劑盒的方法上進(jìn)行優(yōu)化，操作方便，適合大批量提取，提取的DNA 完全能夠滿足本實(shí)驗(yàn)的要求。

隨著煙草集約化種植程度的提高，化肥和農(nóng)藥的大量施用，管理不善、單一作物連續(xù)種植、煙稈還田等因素使得土壤微生物區(qū)系紊亂，導(dǎo)致農(nóng)作物土傳病害日益嚴(yán)重，我們調(diào)查及文獻(xiàn)調(diào)研得知枯萎病和煙草黑脛病是煙草中最常見、危害最嚴(yán)重的病害種類。土傳病害的發(fā)生除了與土壤中病原菌的數(shù)量正相關(guān)外，病原菌的致病力的不同也是造成病害差異的重要因素。尖孢鐮刀菌具有遺傳多樣性，存在不同菌株?；秃蜕硇》N等，而且不同生理小種對(duì)不同寄主的致病力不同［23］。該實(shí)驗(yàn)由病原菌ITS 區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，通過qPCR 擴(kuò)增分析煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌在植煙土樣中的數(shù)量，可以在一定程度上反映煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌對(duì)煙株的致病力，但不能絕對(duì)辨別兩個(gè)菌株轉(zhuǎn)化型和生理小種。土傳病害的發(fā)生還有一些重要的外部因素，溫度、pH 值和光照對(duì)煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌的生物學(xué)特性都有影響［24-25］，高溫和高濕有利于土傳病害的發(fā)生［26］。本研究針對(duì)染病和健康土壤的病原菌數(shù)量，以植煙土樣中兩種常見病原菌（煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌）為參考進(jìn)行定量檢測(cè)，從Ct 值可以看出染病土壤Ct 值小于健康土壤，可見染病土壤中的2種病原菌的數(shù)量高于健康土壤，為這兩類土傳病害的發(fā)生提供一定的預(yù)警效果，為后期利用土壤滅菌和生物防治土壤中病原菌提供技術(shù)參考。

目前對(duì)于這兩類病原菌引起的土傳病害的防治，往往是施用大量的化學(xué)藥劑，從而環(huán)境污染、藥物殘留、破壞生態(tài)平衡等缺點(diǎn)已經(jīng)不符合農(nóng)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展的要求。因此，在檢測(cè)煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌數(shù)量的基礎(chǔ)上，針對(duì)輕度、中度的染病植煙土壤可以采用土壤微生態(tài)調(diào)節(jié)劑為生物修復(fù)策略，而對(duì)于重度污染的植煙土壤，應(yīng)實(shí)施高效無(wú)污染熏蒸等土壤消毒劑。該研究為測(cè)土噴施調(diào)節(jié)劑或消毒劑防控土傳病害提供一定技術(shù)依據(jù)，完全符合當(dāng)今煙葉綠色發(fā)展要求。

4 結(jié)論

本研究以植煙土壤中常見的病原菌煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌為研究對(duì)象，以染病和健康土壤中的病原菌DNA 為檢測(cè)目標(biāo)，優(yōu)化植煙土壤中病原微生物DNA 提取方法，建立煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌的PCR 和qPCR 反應(yīng)體系，篩選出特異性的兩對(duì)引物，研究結(jié)果表明PCR 和qPCR 聯(lián)用技術(shù)能夠快速地分辨和檢測(cè)植煙土壤中尖孢鐮刀菌和煙草疫霉菌DNA的濃度，能夠一定程度上反應(yīng)出植煙土壤中兩種病原菌的數(shù)量。該研究對(duì)枯萎病和煙草黑脛病實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和前期預(yù)警具有重要作用，可以為煙草土傳病害的防控策略提供參考價(jià)值。

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