劉峰峰，方 欣，李林林，譚再鈺，葉明樵，朱婷婷，黃友誼，潘 勇

（1.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，湖北 武漢 430040；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430077；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430077）

【研究意義】雪茄煙作為一種特殊煙草制品，以其品質(zhì)特征煙氣濃郁，香氣醇厚豐滿，吃味香苦透甜，同時相對危害較?。?］，被多數(shù)消費者所認(rèn)可，近些年發(fā)展較快。雪茄煙質(zhì)量評價指標(biāo)中，香氣是其中最重要指標(biāo)之一，主要包括香氣質(zhì)、香氣量和香型等，由香氣成分的種類、含量、比例及其相互作用等決定香氣量大、質(zhì)純、香型突出等特點是優(yōu)質(zhì)煙葉的一般要求?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雪茄煙品質(zhì)除受到煙葉原料［2］如品種、產(chǎn)地、栽培技術(shù)、采收方式等因素的影響外，晾曬、調(diào)制、發(fā)酵等加工工藝對雪茄煙葉質(zhì)量同樣有著至關(guān)重要的影響［3］。其中煙葉發(fā)酵是雪茄煙葉品質(zhì)在田間成熟及晾制完成基礎(chǔ)上的進(jìn)一步提升，是改善雪茄煙葉品質(zhì)的重要工序。研究表明，發(fā)酵過程中翻堆處理［4］、濕度［5］、溫度［6］、堆積時間［7］等外部條件的變化，影響著煙葉香氣、吃味等感官以及理化品質(zhì)。也有通過外源添加非煙葉提取物以改善煙葉品質(zhì)，在雪茄煙葉發(fā)酵時添加米酒、菊花浸提液，能夠使發(fā)酵后雪茄煙葉中性致香物質(zhì)含量更加協(xié)調(diào)，明顯改善煙葉的香氣和吃味［8］。【本研究切入點】煙葉的二次發(fā)酵，被稱之為深度發(fā)酵，與初次發(fā)酵促進(jìn)煙葉中化學(xué)成分的快速變化不同，二次發(fā)酵的主要目的是使煙葉成分更加協(xié)調(diào)，如香味醇、刺激性降低、點燃的持火能力增強(qiáng)等，是一個緩慢的醇化過程，以提升煙葉的工業(yè)可用性［9-10］。目前對于雪茄煙葉發(fā)酵方面的研究主要集中在初次發(fā)酵方面，而對于深度發(fā)酵方面的研究較少，深度發(fā)酵過程中煙葉的內(nèi)在成分變化尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對實際深度發(fā)酵大生產(chǎn)中雪茄茄衣?lián)]發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析，研究深度發(fā)酵對雪茄煙葉揮發(fā)性成分的影響，為提高國產(chǎn)雪茄煙葉原料品質(zhì)的工藝等提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試雪茄煙葉發(fā)酵樣品為墨西哥HABABO 茄衣。主要儀器包括固相微萃取手柄（美國Supleco公司）、85 μm PA 萃取頭（美國Supleco 公司）、TRACE 1300+ISQ7000 氣質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛世爾科技）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品前處理 試驗時間（供試茄衣樣品發(fā)酵時間）為2019 年8 月23 日至2020 年1 月19 日，發(fā)酵過程中由經(jīng)驗豐富的加工人員根據(jù)堆垛發(fā)酵情況，進(jìn)行翻堆處理，在發(fā)酵的不同翻堆階段按五點法取樣后混合均勻，采樣時間依次為：原料（2019 年8 月23 日）、發(fā)酵前期（2019 年9 月30 日）、發(fā)酵中期（2019 年11 月8 日）、發(fā)酵后期（2019 年12 月3 日）、出堆（2020 年1 月19 日）。

參照煙草及煙草制品式樣的制備和水分測定（YC/T 31-1996）的樣品處理方法，將采集的樣品先用毛刷去掉葉片上的細(xì)土和沙粒，將煙葉放入烘箱中，在40 ℃下烘3～4 h，直到用手捻碎即可；將烘干的煙草樣品粉碎過孔徑0.38 mm 篩，未過篩的細(xì)脈重新研磨過篩；將過篩粉末裝入潔凈干燥的試劑瓶內(nèi)密封，充分搖勻，-20 ℃低溫保存。

1.2.2 GC-MS 分析 準(zhǔn)確稱取煙葉粉碎后樣品1.0 g 置于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，添加50 μL 乙酸苯乙酯（1.011 μg/μL）內(nèi)標(biāo)，密封。頂空條件：平衡溫度70 ℃、平衡時間20 min，吸附溫度70 ℃、吸附時間30 min；從頂空瓶中拔出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，在 250 ℃下解吸5 min，進(jìn)行GC/MS 檢測。GC/MS 條件：色譜柱，TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載 氣，He；不分流進(jìn)樣，流速，0.8 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，升溫程序：初溫60 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的速度升至180 ℃，保持2 min，以6 ℃/min的速度升至260 ℃，保持2 min；電離能70 eV；質(zhì)量數(shù)范圍35～450 amu。

1.3 數(shù)據(jù)分析

由正構(gòu)烷烴標(biāo)樣和發(fā)酵樣品中各香氣成分色譜峰的保留時間計算目標(biāo)香氣物質(zhì)的保留指數(shù)（RIx）：

式中，RTx為目標(biāo)香氣物質(zhì)的保留時間，n 和n+1分別為目標(biāo)化合物流出前后的正構(gòu)烷烴所含碳原子的數(shù)目，RTn+1和RTn分別表示他們的保留時間。經(jīng)計算機(jī)通過NIST 譜庫進(jìn)行檢索匹配，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中的匹配度和保留指數(shù)（RI）進(jìn)行定性。假定校正因子為1，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。

試驗數(shù)據(jù)使用軟件EXCEL2006、SPSS23.0 和Origin 2019 整理及繪制基本圖表，火山圖使用聯(lián)川生物平臺(www.omicstudio.cn)中云工具進(jìn)行繪制與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 深度發(fā)酵過程中雪茄茄衣?lián)]發(fā)性成分的組成

為了更好地了解深度發(fā)酵對雪茄茄衣香氣品質(zhì)的影響，采用HS-SPME/GC-MS 方法檢測不同堆垛發(fā)酵時間采集的茄衣樣品中的揮發(fā)性成分。從各階段樣品中共檢測出37 種揮發(fā)性成分，揮發(fā)性成分具體種類及相對含量見表1。根據(jù)物質(zhì)結(jié)構(gòu)將它們分為6 類，包括含氮化合物11 種（29.37%）、醇類9種（24.32%）、酯類5種（13.51%）、酮類6 種（16.22%）、烴類4 種（10.81%）、醛類2 種（5.41%），可見茄衣的揮發(fā)性成分在深度發(fā)酵過程中均以含氮化合物、醇類、酮類、酯類為主。揮發(fā)物種類隨深度發(fā)酵的進(jìn)行有少量的增加，但無明顯變化，其中有28 種揮發(fā)物存在于深度發(fā)酵的所有階段（圖1），將構(gòu)成雪茄茄衣特征性的香氣類型。

圖1 雪茄茄衣深度發(fā)酵過程中揮發(fā)物種類韋恩圖Fig.1 Wayne diagram of volatile compounds during deep fermentation of cigar wrappers

表1 SPME/GC-MS 測定雪茄茄衣各階段樣品的揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components of cigar wrappers at different stages determined by SPME/GC-MS

2.2 雪茄茄衣深度發(fā)酵過程中揮發(fā)性成分的變化

由圖2、圖3 可知，在茄衣?lián)]發(fā)物中，以揮發(fā)性煙堿相對含量最高，占揮發(fā)物總量的76.28%～83.32%，其在發(fā)酵過程中相對含量先增后減，整體呈增加趨勢，與揮發(fā)物總量變化趨勢相同；其次為新植二烯，占揮發(fā)物總量的11.60%～15.88%，其在發(fā)酵過程中相對含量先減后增，整體呈上升趨勢。揮發(fā)性煙堿先增后減的變化趨勢可能與茄衣生物堿之間的轉(zhuǎn)化以及在深度發(fā)酵過程中揮發(fā)至空氣中有關(guān)。新植二烯是茄衣中性揮發(fā)性成分中相對含量最高的物質(zhì)，這與前人研究結(jié)果一致，其本身不帶香氣或香氣較弱［11-13］，但對香氣質(zhì)、柔細(xì)度、透發(fā)性等評吸效果影響較大［14］。除煙堿及新植二烯外，茄衣?lián)]發(fā)性成分仍以含氮化合物為主，深度發(fā)酵前后整體呈顯著增加趨勢，主要增加階段在發(fā)酵前期及出堆階段，發(fā)酵中期、后期無顯著性變化；其次為酮類，變化趨勢及主要增加階段與含氮化合物一致；醇類、酯類及其他相對含量較低，其中醇類呈減少趨勢，酯類呈增加趨勢，但都沒有顯著性差異。

圖2 雪茄茄衣深度發(fā)酵各階段揮發(fā)物種類及含量Fig.2 Types and content accumulation of volatiles in various stages of deep fermentation of cigar wrappers

圖3 雪茄茄衣深度發(fā)酵各階段揮發(fā)物種類及含量變化Fig.3 Changes in types and content accumulation of volatiles in various stages of deep fermentation of cigar wrappers

2.3 雪茄茄衣深度發(fā)酵前后主要差異揮發(fā)性成分

差異揮發(fā)物的篩選能夠更加明確深度發(fā)酵對雪茄茄衣?lián)]發(fā)物的主要影響，根據(jù)雪茄茄衣深度發(fā)酵出堆樣與原料中揮發(fā)性成分的含量，通過倍數(shù)變化分析（Fold change，F(xiàn)C）和獨立樣本T檢驗，分析了茄衣深度發(fā)酵前后具有顯著變化的揮發(fā)物，以|log2FC|＞1 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選雪茄茄衣深度發(fā)酵前后主要差異揮發(fā)物，結(jié)果如圖4 所示，茄衣深度發(fā)酵前后共篩選到差異性揮發(fā)成分13 種，包括酮類六氫假紫羅酮、香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、植酮、法尼基丙酮，含氮化合物3-乙?；拎?、1-乙?；量┩椤Ⅺ溗久?、二烯煙堿、2,3’-聯(lián)吡啶，醇類2-甲基-十一烷醇、香紫蘇醇，以及酯類（3-羥基-2,2,4-三甲基戊基）2-甲基丙酸酯。

圖4 雪茄茄衣深度發(fā)酵前后的差異揮發(fā)物Fig.4 Differential volatile compounds of cigar wrappers before and after deep fermentation

3 討論

雪茄煙葉的發(fā)酵分為初次發(fā)酵和二次發(fā)酵，初次發(fā)酵是促進(jìn)煙葉成分的快速變化，主要使煙葉經(jīng)歷快速生化反應(yīng)過程，沒有經(jīng)過發(fā)酵的煙葉不僅含有青雜氣、土雜氣、木質(zhì)氣，而且煙氣粗糙，刺激性大；二次發(fā)酵又稱為深度發(fā)酵，與初次發(fā)酵不同，主要目的是使煙葉成分更加協(xié)調(diào)，深度發(fā)酵過程中，雪茄茄衣?lián)]發(fā)物種類變化較小，揮發(fā)性成分的變化主要在于各揮發(fā)性成分的含量方面的變化。本研究結(jié)果表明，在發(fā)酵前中期揮發(fā)性成分含量增加，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵程度的增加，整體香氣含量開始呈現(xiàn)下降趨勢，說明一定程度的發(fā)酵整體上能夠提高煙葉香氣成分的含量，但發(fā)酵時間過長并不利于香氣成分的積累，與時向東等［13］研究結(jié)果相符。本研究從雪茄煙葉整個的深度發(fā)酵過程中檢測到的37 種揮發(fā)性成分中，共篩選到13 種發(fā)酵前后具有顯著變化的關(guān)鍵揮發(fā)物，且均呈現(xiàn)顯著上調(diào)趨勢，這是本研究主要的創(chuàng)新之處。這13 種差異揮發(fā)物可能是深度發(fā)酵過程種煙葉成分協(xié)調(diào)的關(guān)鍵揮發(fā)性成分。從雪茄煙葉二次發(fā)酵過程中篩選出的13種主要的關(guān)鍵揮發(fā)性成分，包括六氫假紫羅酮、

香葉基丙酮、β-紫羅蘭酮、植酮、法尼基丙酮、3-乙?；拎ぁ?-乙?；量┩椤Ⅺ溗久?、二烯煙堿、2,3’-聯(lián)吡啶、2-甲基-十一烷醇、香紫蘇醇和（3-羥基-2,2,4-三甲基戊基）2-甲基丙酸酯。雪茄煙葉關(guān)鍵揮發(fā)物中植酮、香葉基丙酮、法尼基丙酮、六氫假紫羅酮、β-紫羅蘭酮屬于質(zhì)體色素降解產(chǎn)物，包括葉綠素及類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物，與煙草香氣及感官質(zhì)量關(guān)系密切［15］，如香葉基丙酮具有穿透性的青甜香、微玫瑰香，β-紫羅蘭酮有紫羅蘭香味，與香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、濃度和余味呈顯著正相關(guān)，可增加煙草清甜香增加煙香、改善吃味和掩蓋雜氣的作用［16-17］，這表明葉綠素及類胡蘿卜素這些質(zhì)體色素的降解可能是雪茄煙葉深度發(fā)酵過程中，揮發(fā)性成分增加的主要原因，與深度發(fā)酵對煙葉品質(zhì)的改善密切相關(guān)。此外，3-乙?；拎?、1-乙酰基吡咯烷和2,3’-聯(lián)吡啶等氮雜環(huán)化合物屬于非酶棕色化反應(yīng)產(chǎn)物，具有烤香、烘焙香和堅果香等香味特征［18］。雪茄煙葉深度發(fā)酵后品質(zhì)的協(xié)調(diào)，可能與這些香氣物質(zhì)含量的增加有關(guān)。而麥司明和二烯煙堿等煙堿類的揮發(fā)物的增加可能來自于煙堿的轉(zhuǎn)化，與后期揮發(fā)性煙堿的降低有關(guān)［19］。但對于這些揮發(fā)物在雪茄煙支燃燒過程中的變化以及對煙支評吸結(jié)果的具體影響等還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究從雪茄茄衣深度發(fā)酵樣品中鑒定出揮發(fā)性成分37 種，揮發(fā)物種類以含氮化合物和醇類為主，其次為酯類、酮類，烴類及醇類種類較少；相對含量以煙堿最高，其次為新植二烯，除煙堿和新植二烯外，茄衣?lián)]發(fā)物仍以含氮化合物相對含量最高，其次為酮類物質(zhì)。深度發(fā)酵處理對雪茄茄衣?lián)]發(fā)物種類影響較小，但揮發(fā)物含量明顯增加，從深度發(fā)酵前后共篩選出13 種差異性揮發(fā)物，均顯著上調(diào)（log2FC ＞1、P＜0.05）。顯著增加的揮發(fā)物主要包括質(zhì)體色素的降解產(chǎn)物植酮、香葉基丙酮、法尼基丙酮等；棕色化反應(yīng)的產(chǎn)物3-乙?；拎ぁ?-乙?；量┩?；煙堿的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物麥司明和二烯煙堿。